2.3.1. Phương pháp khử trùng hạt.
Nguyên tắc
Dung dịch khử trùng phải bảo vệ được mô thực vật và thời gian khử trùng phải đảm bảo tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật.
Mục tiêu
Thí nghiệm nhằm khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng hạt cẩm chướng bằng Javel để tỉ lệ nảy mầm là cao nhất và cây phát triển tốt nhất.
Tiến hành
Hình 2.7: Qui trình khử mẫu.
Tiến hành khử trùng mẫu theo qui trình trên, đặc biệt từ bước ngâm cồn 70 % (trong 1 – 2 phút) trở đi phải được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Khảo sát nồng độ Javel khử trùng ở 1,5%, 3,0%, 5%.
Khảo sát thời gian khử trùng ngâm hạt trong Javel 5 phút, 10 phút, 15 phút ở mỗi nồng độ.
Hạt cẩm chướng sau khi khử trùng sẽ được cấy vào bình tam giác chứa môi trường MS.
Thực hiện 8 mẫu/bình, 5 bình/nghiệm thức.
Rửa nước cất vô trùng (3 lần) Hạt cẩm chướng Rửa nước Rửa xà bông Rửa nước cất Ngâm cồn 70 % (trong 1 – 2 phút)
Rửa nước cất vô trùng
Ngâm Javel (NaOCl)
Thấm khô
Chỉ tiêu theo dõi
Số mẫu nhiễm / tổng mẫu sau 6 ngày vô mẫu.
Số hạt nảy mầm / tổng mẫu sau 10 ngày vô mẫu.
Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của cây bằng cách đo chiều cao và đường kính tử diệp sau 13 ngày vô mẫu.
2.3.2. Phương pháp khảo sát môi trường tái sinh cây cẩm chướng từ lá Nguyên tắc Nguyên tắc
Môi trường tái sinh là môi trường cung cấp đủ chất để mô lá có thể hình thành mô sẹo và tạo chồi, tái sinh cây.
Mục tiêu
Khảo sát môi trường tái sinh tối ưu để có thể tái sinh chồi từ tử diệp cẩm chướng sau thí nghiệm chuyển gen.
Tiến hành
Tử diệp cẩm chướng có kích thước 4x8 mm được cắt rời và nuôi cấy in vitro trên 11 môi trường (TS0, TS1, TS2, TS3, TS4, TS5, TS6, TS7, TS8, TS9, TS10).
Thực hiện 8 mẫu/bình, 2 bình/nghiệm thức.
Theo dõi và ghi nhận khả năng tái sinh của mẫu sau 8 tuần cấy chuyển. (mẫu được cấy chuyền sang môi trường mới sau 4 tuần).
2.3.3. Phương pháp khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycine. Nguyên tắc Nguyên tắc
Hygromycin - là loại kháng sinh phổ biến aminoglycosidic được tổng hợp từ
vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus, được dùng để chọn lọc các thể chuyển gen có mang gen kháng kháng sinh – gen hpt. Hygromycin ức chế các tế bào khác thông qua việc bất hoạt quá trình sinh tổng hợp protein. Đối với những tế bào mang gen hpt,
các tế bào này sẽ sản sinh ra enzyme kinase ( hygromycin phosphotransferase, HPT), enzyme này sẽ bất hoạt hygromycin thông qua quá trình phosphate hóa.
Hygromycin không bền với điều kiện bên ngoài, bị phân hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ. Vì thế, quá trình chọn lọc hygromycin chỉ diễn ra từ 2-3 tuần. Sau đó, môi trường chọn lọc cần đựơc thay mới. [9,17, 29]
Mục tiêu
Khảo sát khả năng chống chịu của mô sẹo tử diệp cẩm chướng chưa chuyển gen đối với kháng sinh hygromycin, nhằm phục vụ cho quá trình chọn lọc mô sẹo được chuyển gen sau này.
Tiến hành
Mẫu tử diệp được cấy lên môi trường tái sinh với nồng độ kháng sinh hygromycin tăng dần 0mg/l; 4mg/l; 8mg/l; 12mg/l; 16mg/l; 20mg/l.
Thực hiện 8 mẫu/bình, 2 bình/nghiệm thức.
Ghi nhận ảnh hưởng của mẫu tử diệp sau 1 đến 4 tuần.
2.3.4. Phương pháp chuyển gen ipt gián tiếp nhờ vi khuẩn A. tumefaciences kết hợp sóng siêu âm. tumefaciences kết hợp sóng siêu âm.
Nguyên tắc
Sóng siêu âm tạo vết thương hay nói đúng hơn là các lỗ (kênh) trên mô lá, tăng khả năng chuyển T-DNA của các tế bào vi khuẩn vào tế bào thực vật, đồng thời vết thương thực vật tiết ra những hợp chất phenol đặc biệt kích thích T-DNA từ Ti
plasmid của vi khuẩn A. tumefaciens tiết ra rồi chuyển vào cây để gắn bền vững với
bộ gen (genome) của cây. Trong thí nghiệm này, chúng ta bổ sung thêm hoạt chất acetomyringone có tính năng tương tự như hợp chất mà cây tiết ra khi bị thương để thúc đẩy quá trình chuyển T-DNA ra ngoài. Ngoài ra, như đã biết sóng siêu âm tạo vết thương bằng cách gia tăng các bóng khí, khi bóng khí vỡ tạo áp suất và nhiệt năng giúp phá vỡ màng tế bào, các bọt khí sót lại có thể che lắp các kênh, làm giảm hiệu suất chuyển gen. Để tránh trường hợp này, ta sử dụng phương pháp hút chân không để phá vỡ các bọt khí. Như vậy, các T-DNA có thể dễ dàng vào trong tế bào thực vật mà không bị cản trở.
Mục tiêu
Chuyển gen vào mô lá cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp A. tumefaciens
kết hợp sóng siêu âm. Tiến hành
Lá cẩm chướng được cắt rời ra (kích thước khoảng 4 x 8mm). Sau đó đem cho vào môi trường MS lỏng có bổ sung acetosyringone với nồng độ 200mg/l, lắc nhẹ.
Sau đó, cho 20ml môi trường LB chứa vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
vào trong bình chứa mẫu lá và acetosyringone.
Đưa bình chứa các mẫu lá vào thiết bị bắn sóng tạo vết thương bằng sóng siêu âm 35kHz với thời gian bắn sóng là 30 giây.
Đưa bình vào máy hút chân không trong 30 giây.
Đem hỗn hợp này lắc khoảng 1 giờ với tốc độ 150 vòng/phút.
Sau giai đoạn chuyển gen, mẫu lá được đem ra thấm bằng giấy thấm và cấy vào các bình tam giác chứa môi trường tái sinh TS3.
Mẫu lá và vi khuẩn còn bám trên lá được đem ủ trong buồng tối ở 24.5 0C.
Sau 6 ngày nuôi chung (số ngày ủ chung tùy thuộc vào tốc độ phát triển của vi khuẩn), mẫu lá được cấy chuyển qua môi trường chọn lọc chứa hydromycin
có bổ sung thêm cefotaxime (nồng độ 500 mg/l) để diệt các vi khuẩn A.
tumefaciens.
2.3.5. Phương pháp nhuộm GUS. Nguyên tắc Nguyên tắc
Gen gusA được tách từ E. coli (Jelferson và cs, 1987) là gen mã hóa cho sinh
tổng hợp β-glucuronidase. Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm rất đặc trưng.
Mục tiêu
Nhuộm GUS giúp kiểm tra biểu hiện tạm thời của gen chuyển dựa vào sự hiện diện của các đốm có màu chàm.
Tiến hành
Sau quá trình chọn lọc bằng kháng sinh hygromycin, những mẫu mô sẹo còn sống (là những mẫu nghi ngờ được chuyển gen thành công), ta lấy một vài mẫu để nhuộm GUS.
Chuẩn bị hóa chất dùng trong phản ứng nhuộm GUS:
Stock X – Gluc 5 ml
Dung dịch đệm NaPO4 (pH=7) 10 ml
EDTA 0,25 ml (pH=7) 4 ml
Triton 100x 10% 1 ml.
Sau khi mẫu được ngâm 5 phút trong cồn 70%, lấy mẫu ra và ủ mẫu trong thuốc thử GUS ở 370C trong 24 giờ. Rửa mẫu bằng dung dịch cồn 90% cho đến khi mất màu diệp lục và quan sát màu xanh chàm dưới kính hiển vi.
Đối với mẫu có biểu hiện mạnh, ta có thể nhận thấy ngay màu xanh đặc trưng sau khi ủ mẫu qua đêm mà không cần phải rửa bỏ diệp lục tố.
Nhuộm gus là phương pháp không bền vững vì:
Gen tổng hợp enzyme glucoronidase được chèn vào đoạn genome của protocorm, nhưng gen đích (gen cần chuyển) thì không được chèn.
Gen đích được chèn, nhưng nằm ở trạng thái im lặng qua giai đoạn phiên mã và dịch mã, nên không biểu hiện.
Có trường hợp, gen đích được chuyển và được phiên mã và dịch mã, nhưng gen GUS bị lặn.
Khi quá trình chọn lọc bằng hygromycin không loại bỏ hoàn toàn được thể khảm, thể khảm cũng có khả năng biểu hiện GUS.
2.3.6. Phương pháp tách chiết DNA thực vật. Nguyên tắc Nguyên tắc
Sử dụng các phương pháp cơ học và hóa học để loại bỏ màng, tế bào chất, protein, RNA chỉ thu nhận DNA.
Mục tiêu
Tách chiết DNA tổng số để phân lập các gen cần thiết. Tiến hành
Chuẩn bị các hóa chất (có sẵn trong bộ kit tách chiết DNA): dung dịch tách chiết, dung dịch SDS 20%, hỗn hợp phenol-chloroform, iso-propanol, TE, enzyme RNAse (2 mg/ml), cồn 90.
Thực hiện Tách chiết DNA thực vật
Cắt một mảnh mô nhỏ và nghiền trong eppendorf 1.5 ml bằng dụng cụ nghiền.
Thêm 400 µl dung dịch tách chiết và nghiền thêm vài phút cho mẫu bị nghiền nát.
Thêm 30 µl của dung dịch SDS 20%, vortex và ủ ở 65oC trong 10 phút.
Cho thêm 400 µl hỗn hợp phenol-chloroform, vortex và ly tâm trong 5 phút.
Thu nhận phần dịch trên vào eppendorf mới.
Có thể lặp lại bước 4 và 5.
Cho 300 µl iso-propanol và giữ trong đá khoảng 10 phút.
Ly tâm ở 3000 vòng trong 5 phút và cẩn thận loại bỏ dịch phía trên.
Thêm 100 µl cồn 70%, ly tâm trong 5 phút và cẩn thận loại bỏ cồn.
Để khô mẫu khoảng 20-30 phút và hoà tan kết tủa trong 40 µl TE.
Thêm 2 µl enzyme RNAse (2 mg/ml) và ủ ở 37oC trong 30 phút. DNA có thể sử dụng ngay hoặc bảo quản trong -20oC.
2.3.7. Phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen mong muốn trong tế bào thực vật.
Nguyên tắc
Kỹ thuật PCR được thực hiện khi biết rõ các trình tự đặc hiệu ở hai đầu đoạn DNA cần khuếch đại để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu. Trường hợp chỉ biết có một trình tự đặc hiệu ở một đầu đoạn khuôn thì chỉ thiết kế được một loại mồi, phải sử dụng các kỹ thuật PCR đặc hiệu mới đảm bảo nhân gen có hiệu quả.
Mục tiêu
Khuếch đại đoạn gen ipt lên nhiều lần.
Tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị hoá chất
Để rã đông DNA, buffer 10X, dNTP, primer trong bình đá vụn (luôn luôn giữ các chất trên trong đá, sau khi dùng xong chuyển ngay vào -20oC). Riêng Tag polimerase vẫn giữ ở -20oC cho đến khi sử dụng, sau khi lấy xong phải cất ngay vào -20oC. Nếu không, các chất này sẽ bị giảm tác dụng khi để ở nhiệt độ phòng.
Mồi được cung cấp bởi phòng Công nghệ gen. Trình tự mồi khuếch đại đoạn
gen hpt như sau:
Mồi hpt xuôi: 5’ - CGTCGTTCGAGAAGTTTC - 3’
Mồi hpt ngược: 5’ - TACTTCTACACAGCCATC - 3’
Bước 2: Đánh số lên ống eppendorf. Cho vào ống theo thứ tự:
dNTP: 5 μl (nồng độ đạt 2mM cho mỗi loại dNTP).
10X buffer PCR: 5 μl (có sẵn khi mua Tag Polymerase).
Primer : 2 μl (nồng độ từ 50-100 ng).
Mẫu DNA: 5 μl (thay đổi tuỳ nồng độ DNA từ 50-500 ng DNA thực vật).
Nước: thêm vào để thể tích cuối cùng là 50 μl.
Thể tích của mỗi ống phải là 50 μl.
Nếu mẫu DNA là plasmid chỉ khoảng 1 ng là đủ để chạy mẫu dương tính. Bước 3: Trộn nhẹ đều.
Bước 4: Nhỏ 1 giọt dầu lên bề mặt dung dịch.
Bước 5: Đặt ống PCR. Cho chạy máy theo chương trình đặt sẵn trong máy.
Bước 6: Sau khi phản ứng xong, hút bỏ lớp dầu khỏi ống nghiệm, dùng dung dịch phía dưới để chạy điện di trên gel agarose với điện thế khoảng từ 65-80 volt trong khoảng 1 giờ 30 đến 2 giờ. Xem kết quả trên máy chiếu UV.
2.3.8. Phương pháp chạy điện di. Nguyên tắc Nguyên tắc
Dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường.
Mục tiêu
Kiểm tra độ tinh sạch của DNA đồng thời kiểm tra sự có mặt của gen chuyển. Tiến hành
Chuẩn bị hóa chất dùng trong điện di
Agarose 8.000 mg/l
Ethidium bromide 10 mg/ml
Dung dịch đệm TAE (50X stock):
-Tris base 242 g/l
-Glacial acetic acid 57,1 ml
Chuẩn bị đệm điện di và bảng gel
Pha 0,8g agarose cho vào 100 ml nước cất, đun cho nóng chảy, để nguội đến 60oC, cho 16 μl của ethidium bromide (mang găng tay khi tiếp xúc với chất này). Sau đó đổ vào khuôn đã có sẵn lược để tạo giếng, chờ dung dịch nguội hoàn toàn. Cho
dung dịch đệm TAE x1, nhẹ nhàng rút lược ra và cho dịch DNA (đã cho 5 µl dung dịch Load Dye đệm màu xanh ) vào giếng, cắm điện cực chạy ở khoảng 60 volt trong 2-3 giờ (điện thế càng cao DNA trong gel chạy càng nhanh).
Xem bản gel bằng cách đặt trên máy chiếu UV. Kết quả điện di cho các vạch gọn, phân tách rõ ràng nghĩa là DNA trong mẫu đảm bảo độ tinh sạch cho nghiên cứu. Nếu vạch kéo dài hoặc phân tách không rõ cần xử lý lại từ khâu xử lý proteinase K, để đảm bảo độ tinh sạch của nghiên cứu.
CHƯƠNG 3
3.1. Kết quả khảo sát nồng độ javel và thời gian khử trùng hạt giống Khảo sát khử trùng hạt giống ở nồng độ Javel 1.5% Khảo sát khử trùng hạt giống ở nồng độ Javel 1.5%
Bảng 3.1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu ở nồng độ javel 1.5% Thời gian (phút) Tổng mẫu (mẫu) Tỉ lệ nhiễm (%)
5 40 100
10 40 100
15 40 71.5
Khảo sát khử trùng hạt giống ở nồng độ Javel 3.0%
Bảng 3.2: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu ở nồng độ javel 3.0% Thời gian (phút) Tổng mẫu (mẫu) Tỉ lệ nhiễm (%) Tỉ lệ nảy mầm (%)
5 40 42.5 37.5
10 40 27.5 70.8
15 40 20.0 46.9
Khảo sát khử trùng hạt giống ở nồng độ Javel 5.0%
Bảng 3.3: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu ở nồng độ javel 5.0% Thời gian (phút) Tổng mẫu (mẫu) Tỉ lệ nhiễm (%) Tỉ lệ nảy mầm (%)
5 40 12,5 27.5
10 40 6.5 12.5
100 100 71.5 42.5 27.5 20 12.5 6.5 0.5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 5 10 15 Phút %
TLN ở nồng độ Javel 1.50% TLN ở nồng độ Javel 3.00% TLN ở nồng độ Javel 5.00%
Hình 3.1: Biểu đồ khảo sát tỷ lệ nhiễm ở nồng độ javel 1.5%, 3.0%, 5.0% và thời gian khử trùng hạt 5 phút, 10 phút, 15 phút. 37.5 70.8 46.9 27.5 12.5 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 5 10 15 Phút % TLNM ở nồng độ Javel 3.0% TLNM ở nồng độ Javel 5.0%
Hình 3.2: Biểu đồ khảo sát tỷ lệ nảy mầm ở nồng độ javel 3.0%, 5.0% và thời gian khử trùng hạt 5 phút, 10 phút, 15 phút.
Khảo sát sự phát triển của cây sau khi nảy mầm ở nồng độ Javel 3.0% Sự phát triển của cây sau 13 ngày vào mẫu nồng độ javel 3.0%: Thời gian (phút) Chiều cao trung bình
cây (10-1 cm) Đường kính trung bình lá (10-1 cm) 5 5.2 3.5 10 4.5 4.2 15 2 3
Hình 3.3: Sự phát triển của cây sau 13 ngày ở nồng độ javel 3.0% Nhận xét:
Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm ở nồng độ 1.5% cao nhất (trên 75%), ở nồng độ 3.0% (dưới 42.5%) và 5.0% (dưới 12.5%) thấp hơn. Tỷ lệ nảy mầm ở nồng độ 3% cao nhất (trên 70% ), tỷ lệ nảy mầm ở nồng độ 5.0% (dưới 27.5%) thấp hơn. Đối với thí ngiệm khảo sát nồng độ javel 1.5%, do tỷ lệ nhiễm cao nên không có ghi nhận về kết quả tỷ lệ nảy mầm. Do vậy, ta chọn nồng độ khử trùng tốt nhất là 3% .
Ở thí nghiệm với nồng độ javel 3.0% với thời gian khử trùng là 5 phút thì tỷ lệ nhiễm cao, trong khi đó với thời gian khử trùng 10, 15 phút tỷ lệ nhiễm thấp hơn nhiều. Tuy nhiên do có sự tiếp xúc nhiều giữa mẫu và hóa chất nên có những ảnh
2 4.5 5.2 3.5 4.2 3 0 1 2 3 4 5 6 0 5 10 15 20 Phút mm
hưởng nhất định lên mẫu, ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây. Vì vậy để đánh giá chính xác thời gian khử trùng tốt nhất, ta kết hợp theo dõi sự phát triển của cây bằng cách tiến hành thêm khảo sát chiều dài thân và đường kính lá mầm sau 13 ngày vào mẫu.
Hình 3.4: Các mẫu khử trùng 5, 10, 15 phút ở javel 3.0% sau 10 ngày.
Hình 3.5: Các mẫu khử trùng 5, 10, 15 phút ở javel 5.0% sau 10 ngày.
Sau 13 ngày theo dõi ta thấy khả năng tăng trưởng của hạt ở thời gian khử trùng 10 phút với nồng độ javel 3.0 % là tốt nhất, khả năng tăng trưởng của hạt ở thời gian khử trùng 5 phút cũng tốt, tuy nhiên tỷ lệ nảy mầm lại kém hơn. Còn với thời gian khử trùng 15 phút ảnh hưởng không tốt đến khả năng sinh trưởng bình thường của cây con. Cây con bị chậm lớn đồng thời xuất hiện những lá mầm biến dạng.
Như vậy thời gian khử trùng cho số lượng lớn mẫu đồng thời đảm bảo sự nảy