Phương pháp thử khả năng kháng hygromycin, kanamycin, PPT

1.1.3.1. Phương pháp thử khả năng kháng hygromycin, kanamycin, PPT (phosphinothiricin) của cây tái sinh. (phosphinothiricin) của cây tái sinh.

Các mô sau thí nghiệm chuyển gen được cấy chuyền trên môi trường có kháng sinh hygromycine, kanamycine hoặc PTT với nồng độ thích hợp tùy từng loài thực vật để theo dõi khả năng sinh trưởng, tái sinh tạo chồi, rễ. Mẫu mô đã chuyển gen sẽ sinh trưởng bình thường, mẫu mô không có gen chuyển sẽ chết.

Có thể kiểm tra bằng cách nuôi cấy một số loại mô hay mảnh lá, đoạn thân trên môi trường tạo mô sẹo hoặc tạo chồi có chứa các tác nhân nói trên với nồng độ thích hợp. Trong môi trường này, mô cấy đối chứng sẽ chết, mô cấy có khả năng tạo mô sẹo và chồi bình thường là mô mang gen chuyển.

Có thể thử invivo khả năng kháng hygromycin (gen hpt), kanamycin (gen

kanR), PPT (gen bar) như sau: các mảnh lá của cây 1 tháng tuổi được trồng trong

nhà kính với môi trường MS (không có vitamin và đường), bổ sung 0.5mg/l BA và nồng độ thích hợp hygromycin, kanamycin hoặc PPT tùy thuộc vào loài thực vật. Theo dõi hiện trượng mất màu diệp lục trong khoảng từ 5 – 7 ngày. Mảnh lá của cây chuyển gen vẫn giữ được màu diệp lục, còn mảnh lá của cây đối chứng sẽ chết (hygromycin), bị hạt trắng (kanamycin) hay bị cháy vàng (PPT). Ngoài ra, tính kháng PPT của cây cũng được kiểm tra bằng cách quét 0.3 – 1.0mg/l PTT có bổ sung 0.1mg/l Tween 20% trên phiến lá, ghi nhận khả năng kháng PPT trong 7 ngày. Có thể dùng thuốc trừ cỏ BASTA (vì PPT có hoạt chất của thuốc này) để kiểm tra cây

mang gen bar. Cây chuyển gen lá sẽ vẫn xanh, cây đối chứng sẽ bị cháy vàng. 1.1.3.2. Phương pháp thử GUS

Gen gusA được tách từ E. coli (Jelferson và cs, 1987) là gen mã hóa cho sinh

β-glucuronide. β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng nhận biết sự tồn tại

của gen gusA là X-Gluc (5-bromo-4-4cloro-3-indolyl- β-D-glucuronide). Dung dịch

X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme β-Glucuronidase sẽ chuyển màu xanh chàm rất đặc trưng. Trong tự nhiên, β-Glucuronidase không tồn tại trong thực vật, vì

vậy gusA là một gen chỉ thị rất tốt trong công nghệ gen thực vật. Mặt khác, sản phẩm màu của gen gusA rất bền vững và phản ứng rất ít bị ảnh hưởng của pH nên rất thuận lợi cho việc theo dõi. GusA có mặt trong E. coli và nhiều vi sinh vật khác, vì vậy, thí

nghiệm yêu cầu độ vô trùng nghiêm ngặt. Cách thử

Ủ mô sẹo, lá, thân, rễ... cây chuyển gen trong thuốc thử GUS ở 370C trong 24 giờ. Rửa mẫu bằng dung dịch cồn 70% cho đến khi mất màu diệp lục và quan sát màu xanh chàm dưới kính lúp.

Lưu ý : Đối với mẫu có biểu hiện mạnh, ta có thể nhận thấy ngay màu xanh đặc trưng sau khi ủ mẫu qua đêm mà không cần phải rửa bỏ diệp lục tố [3].

1.1.3.3. Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction)

Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối nước nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp. Nhưng ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử. Nhưng các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 100

o

C. Ở nhiệt độ này DNA (dạng thẳng) sẽ bị biến tính.

Có 3 giai đoạn chính trong một chu kỳ phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ) (thường từ 25 đến 75 chu kỳ).

a. Giai đoạn biến tính (denaturation)

Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt độ cao (thường là từ 94-95oC, lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút,

tất cả các liên kết hydro giữa hai mạch của phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các DNA sợi đơn.

b. Giai đoạn lai

Nhiệt độ được hạ thấp ( thường từ 40-70

o

C, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi được sử dụng khoảng từ 3-5oC) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần được khuếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút (còn được gọi là giai đoạn ủ).

Nếu nhiệt độ quá thấp thì các mồi sẽ gây nên nhiều lỗi và kết quả là sẽ tạo nên nhiều sản phẩm phụ. Nếu nhiệt độ quá cao thì phản ứng sẽ không có kết quả. Công thức để xác định nhiệt độ nóng chảy là Tm=4(G+C)+2(A+T).

c. Giai đoạn kéo dài

Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất. Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã được đánh dấu bởi các mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA mẫu, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.

Ở giai đoạn này của chu kỳ cuối cùng, thời gian được tăng thêm vài phút để các sợi DNA chưa được sao chép xong hoàn thành qúa trình tổng hợp.

Sau mỗi chu kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại được tăng gấp đôi. Ðây là sự nhân bản theo cấp số nhân. Như vậy cứ 1 phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với n chu kỳ sẽ tạo thành 2n bản sao phân tử DNA.

Các thành phần chủ yếu của phản ứng PCR : DNA mẫu, mồi đặc hiệu, enzyme chịu nhiệt (Tag-polymerase), các loại Nu, thành phần môi trường là nước tinh khiết, dung dịch đệm và ion Mg 2+.

Ưu điểm của phương pháp PCR là chỉ cần một thời gian ngắn đã cho một số lượng DNA theo mong muốn.

Sản phẩm của phản ứng PCR được phân tách trên gel agarose đã nhuộm ethimidium bromide và quan sát dưới máy chiếu tia UV. [3, 4, 5 ]

1.1.3.4. Phương pháp phân tích điện di

Phương pháp này được sử dụng trong cả phân tích định tính lẫn trong việc thu nhận mẫu nucleic acid. Nguyên tắc của phương pháp điện di là dưa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Tính linh động của phân tử trong bản thạch (gel) dưới tác động của một điện trường được tính theo công thức:

Log u = Log u0 - KrC

Trong đó, Log u0 là tính linh động của phân tử trong môi trường lỏng, Kr là hằng số làm chậm (retardation coefficient) do cấu trúc gel đồng thời cũng phụ thuộc vào khối lượng phân tử của phân tử nucleic acid, C là nồng độ của gel.

Gel agarose - loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0.5 – 2. kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang. Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại nhờ một hóa chất có tên là ethidium bromide. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Trong thao tác, ethidium bromide được cho vào gel trước khi đổ. Sau điện di, gel dược chiếu sáng bằng tia UV (λ ≈ 300 nm), nucleic acid sẽ hiện hình dưới dạng những vạch màu đỏ cam.

Mặt khác, để ước lượng kích thước các trình tự nucleic acid trong gel agarose, người ta sử dụng một yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử (molecular weight marker - MWM). Đó là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (thang DNA – DNA ladder), thông thường, người ta sử dụng thang DNA là thực khuẩn thể λ được thủy giải bởi enxyme giới hạn HindIII.[3,4]

1.1.3.5. Phương pháp Southern blot

Từ sự phát hiện chuỗi DNA có tính chất tương đồng với probe, phương pháp Southern blot (Southern, 1975) là một đóng góp rất to lớn trong sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật “recombinant DNA”, và xét nghiệm sự thể hiện gen được chuyển nạp, giúp ta hiểu rõ về cấu trúc gen, sự thể hiện gen, và tổ chức bộ gen (Meinkoth và

Wahl 1984). Ngoài ra, Southern blot còn giúp chúng ta chuẩn đoán các bệnh di truyền và phát hiện các pathogen là vi trùng hoặc virus (Karcher 1996).

Sau quá trình lai DNA, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng. Cuối cùng người ta sử dụng kĩ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) để định vị các phân tử lai. Trong kĩ thuật này, người ta đặt một film nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai. Các phân tử lai (đúng hơn là mẫu dò có đánh dấu phóng xạ) sẽ tác động lên film và kết quả được thể hiện qua các chấm đen trên film[3,4].

Phương pháp bao gồm các bước sau

Bước 1: DNA bộ gen được cắt thành

những đoạn kích thước khác nhau bởi một hay nhiều enzyme giới hạn (RE), các đoạn này được phân tách dựa vào kích thước qua điện di trên gel agarose.

Bước 2: DNA được làm biến tính (thành

hai mạch đơn) ngay trên gel rồi được chuyển lên một màng lai. Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn được giữ nguyên.

Bước 3: DNA cố định trên màng lai được

đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ.[3,5]

1.2. Giới thiệu về cây hoa cẩm chướng 1.2.1. Khái quát về cây cẩm chướng

Hình 1.13: Hoa cẩm chướng. (nguồn: hppt://www.wikimedia.com/) Một số loài cẩm chướng  Dianthus alpinus  Dianthus amurensis  Dianthus anatolicus  Dianthus arenarius  Dianthus armeria – Cẩm chướng Deptford  Dianthus barbatus – Cẩm chướng thơm lùn  Dianthus biflorus  Dianthus brevicaulis  Dianthus callizonus  Dianthus campestris  Dianthus capitatus  Dianthus carthusianorum – Cẩm chướng Carthusia  Dianthus caryophyllus L.- Cẩm chướng thơm  Dianthus chinensis - Cẩm chướng gấm  Dianthus cruentus  Dianthus deltoides – Cẩm chướng trinh nữ  Dianthus erinaceus  Dianthus freynii  Dianthus fruticosus  Dianthus furcatus  Dianthus gallicus – Cẩm

chướng Pháp hay cẩm chướng Jersey  Dianthus giganteus Giới: Plantae Bộ: Caryophyllales Họ: Caryophyllaceae Chi: Dianthus

 Dianthus glacialis  Dianthus gracilis  Dianthus graniticus  Dianthus gratianopolitanus – Cẩm chướng Cheddar  Dianthus haematocalyx  Dianthus knappii  Dianthus lusitanus  Dianthus microlepsis  Dianthus monspessulanus  Dianthus myrtinervius  Dianthus nardiformis  Dianthus nitidus  Dianthus pavonius  Dianthus petraeus  Dianthus pinifolius  Dianthus plumarius – Cẩm

chướng dại, cẩm chướng cỏ

 Dianthus pungens

 Dianthus repens – Cẩm chướng

Bắc cực  Dianthus scardicus  Dianthus seguieri  Dianthus simulans  Dianthus spiculifolius  Dianthus squarrosus  Dianthus subacaulis  Dianthus superbus – Cẩm chướng lớn  Dianthus zonatu  Dianthus sylvestris

Chi cẩm chướng (danh pháp khoa học: Dianthus) là một chi của khoảng 300 loài trong thực vật có hoa của họ Cẩm chướng (Caryophyllaceae), có nguồn gốc chủ

yếu ở châu Âu và châu Á, với một vài loài được tìm thấy ở miền bắc châu Phi, và

một loài (D. repens) ở khu vực ven Bắc cực của Bắc Mỹ. Tên gọi chung trong tiếng Việt của các loài này là cẩm chướng. Tên gọi khoa học Dianthus có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp dios ("thần, thánh") và anthos ("hoa"), và nó được nhà thực vật học Hy

Lạp Theophrastus (khoảng 370 TCN - 285 TCN) đặt ra.

Các loài trong chi này chủ yếu là cây thân thảo sống lâu năm, một số ít là một năm hay hai năm, và một số là các cây bụi thấp với thân dạng gỗ. Lá đơn, mọc đối, màu lục-xám hay lục-lam. Hoa có 5 cánh hoa, thường với mép nhăn, và gần như ở

mọi loài thì có màu từ hồng nhạt tới sẫm. Một loài (D. knappii) có hoa màu vàng với

phần ở giữa màu tím tía.[2, 18, 19, 22]

1.2.1.1 Lịch sử phát triển

Cẩm chướng có tên khoa học Diantus thuộc họ thanh trúc (Caryophyllaceae)

có nguồn gốc từ Châu Âu. Sở dĩ có tên cẩm chướng là vì cây cho nhiều hoa, hoa màu sắc đẹp, giống một bức trướng bằng gấm với nhiều màu trắng, đỏ hồng, tím... nhiều giống trên cùng một cánh hoa cũng có tới 2 - 3 màu. Có giống hoa đơn, hoa kép, nhiều dáng vẻ, mọc ở đầu cành. Các cành thanh mảnh, có đốt mang lá hẹp. Cây mọc thành một bụi. Hoa dùng cắm lọ nhỏ, cắm bàn chông hay cắm bát.

Năm 1970, lần đầu tiên các nhà làm vườn Pháp đã tạo ra giống cẩm chướng Remontant, cây cao, ra hoa nhiều lần trong năm. Năm 1846, nuôi trồng được nhiều giống cẩm chướng hoang dại và điều khiển chúng ra hoa quanh năm. Năm 1852, cẩm chướng từ Châu Âu du nhập vào Mỹ. Tại đây đã có nhiều nghiên cứu về cây cẩm chướng. Họ đã gây đột biến và lai tạo để tạo ra nhiều giống mới như North, Berwick, Maine và William Sim.. với nhiều hình dáng và màu sắc hoa phong phú.

Cây cẩm chướng du nhập vào Việt Nam từ thập niên 60, chủ yếu được trồng làm cây cảnh, trang trí. Về sau, đến những năm 80 các giống cây cẩm chướng từ các nước Pháp, Hà Lan, Trung Quốc… du nhập vào nước ta. Hiện nay, cây hoa cẩm chướng không chỉ được trồng để trang trí mà được sản xuất để phục vụ mục đích kinh tế, sản xuất hoa cắt cành.

1.2.1.2 Tình hình sản xuất hiện nay

 Trên thế giới

Hoa cẩm chướng với màu sắc đa dạng, hình dáng phong phú, nhiều chủng loài, mùi hương hấp dẫn, tạo cảm giác vui tươi, khỏe khoắn cho mọi người đang ngày càng được ưa thích. Với những ưu điểm trên, cẩm chướng đã trở thành một trong bốn loài hoa cắt cành phổ biến trên thế giới, chiếm 17% sản lượng hoa cắt cành. Itali là nước có diện tích trồng cẩm chướng lớn nhât trên thế giới với sản lượng 2500 triệu cành vào năm 1995, Hà Lan đúng thứ hai với sản lượng 1800 triệu cành, Ba Lan đứng thứ ba với sản lượng 400 triệu cành… Colombia được xem là thiên

đường của hoa cẩm chướng với chất lượng hoa tốt nhất thế giới. Các nước khác như Israel, Trung Quốc cũng sản xuất hoa cẩm chướng với số lượng đáng kể.

 Trong nước

Trước đây hoa cẩm chướng được trồng làm cảnh trang trí. Từ năm 1975 đã có sản xuất hoa cắt cành với những giống nhập trước 1975. Từ năm 1995 có nhiều giống hoa cẩm chướng được nhập nội có nguồn gốc từ Hà lan, Trung quốc với màu sắc đa dạng phong phú.

Hiện ở nước ta đã tiến hành trồng được 3 loài Dianthus làm hoa cảnh tại Đà

Lạt là D. barbatus L., D.sinensis L. và D.caryophyllus L.. Cây hoa cẩm chướng phát

triển ở vùng có độ cao khác nhau tuy nhiên chất lượng hoa khác nhau. Vùng Vạn thành – phường 5, Thái Phiên Phường 12, Phường 7, 8 là những nơi trồng nhiều hoa cẩm chướng tại Đà Lạt. Vì vậy nên phổ biến cho người trồng hoa biết thêm những đặc điểm về các loài hay giống cẩm chướng này để trồng cho phù hợp.

Tại nước ta cẩm chướng có khoảng trên 20 giống được trồng trọt với mục đích cắt cành. Các giống trồng trọt hiện nay được chia theo nhóm sau:

 Nhóm hoa chùm: Màu đỏ, hồng, trắng, kem...Hoa nhỏ, cành thấp 30-40cm, mắt nhặt. Thời gian sinh trưởng 18-24 tháng.

 Nhóm hoa đơn: Màu đỏ, hoa lớn, cánh cao 70-80 cm, mắt thưa, ít chồi, thời gian sinh trưởng 15-18 tháng.

 Màu hồng, vàng, trắng, cam, kem, Vàng viền đỏ, hồng viền tím, đỏ viền trắng, hồng viền trắng... Hoa lớn, cành cao 65-75 cm, mắt thưa, nhiều chồi, thời gian sinh trưởng 18-24 tháng.

Hoa cẩm chướng có diện tích canh tác không lớn, chủ yếu trồng trong nhà có mái che plastic. Hàng năm Đà lạt cung cấp khoảng 0,3-0,5 triệu cành hoa cẩm chướng các loại. Hiện nay, Việt Nam đã xuất khẩu được các sản phẩm hoa cắt cành như hồng, phong lan, cúc, đồng tiền, cẩm chướng, ly ly, sao tím...sang Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan, Nhật bản, Singapore. Australia, Ảrập; vạn niên thanh, mai chiếu thủy, mai cảnh... sang Trung Quốc, Hoa Kỳ, Nhật Bản. Trong các loại hoa cắt

cành phổ biến xuất khẩu của Việt Nam thì hoa cẩm chướng đặc biệt đem lại nhiều lợi nhuận.[20, 23, 29]

Bảng 1.1: Tham khảo thị trường xuất khẩu hoa cây cảnh tháng 04/2007 Thị trường xuất khẩu Chủng loại Kim ngạch xuất khẩu (USD)

Nhật bản

Cúc, cẩm chướng,

hồng, kỳ lân 404.843,58