Hình 2.6: Sơ đồ qui trình tạo cây cẩm chướng chuyển gen. Thuyết minh qui trình
Tạo cây cẩm chướng in vitro: khử trùng hạt bằng javel, nuôi cấy cây cẩm
chướng trên môi trường MSB5.
Vector A. tumefaciens mang plasmid pVDH396 tái tổ hợp được cung cấp bởi
Viện Sinh học Nhiệt đới.
Khảo sát môi trường tái sinh: tìm môi trường thích hợp để hiệu suất tái sinh cây từ lá là cao nhất.
Khảo sát nồng độ hygromycin: tìm nồng độ hygromycin thích hợp để chọn lọc mô mang gen chuyển.
Môi trường tái sinh Chuyển gen
Chọn lọc trên môi trường tái sinh chứa hygromycin
Biểu hiện tạm thời (nhuộm GUS) Khử trùng
Nuôi cấy invitro
Mẫu lá Hạt cẩm chướng Vector A.tumefaciens mang plasmid pVDH396 tái tổ hợp
Kết quả biểu hiện gen tạm thời Cây chuyển gen
Khảo sát môi trường tái sinh
Khảo sát nồng độ hygromycin
Chuyển gen bằng cách bắn sóng tạo vết thương trên mô lá, lắc mô lá cùng vi khuẩn chung với nhau trong môi trường MS lỏng, hút chân không để loại hết bọt khí, tiếp tục lắc mô lá cùng vi khuẩn chung với nhau trong môi trường MS lỏng khoảng 1 giờ 30 phút, ủ vi khuẩn và mô lá trên môi trường tái sinh trong 6 ngày.
Kiểm tra biểu hiện sự có mặt của gen chuyển trong mô lá bằng phương pháp nhuộm GUS.
Chọn lọc mô lá mang gen chuyển trên môi trường tái sinh chứa nồng độ hygromycin thích hợp.
Cây chuyển gen là cây phát triển từ những mô đã tái sinh chồi và còn sống sau quá trình chọn lọc (để xác định rõ cần kiểm tra bằng các phương pháp sinh học phân tử như PCR hay điện di…).