Phương pháp khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycine

 Nguyên tắc

Môi trường tái sinh là môi trường cung cấp đủ chất để mô lá có thể hình thành mô sẹo và tạo chồi, tái sinh cây.

 Mục tiêu

Khảo sát môi trường tái sinh tối ưu để có thể tái sinh chồi từ tử diệp cẩm chướng sau thí nghiệm chuyển gen.

 Tiến hành

Tử diệp cẩm chướng có kích thước 4x8 mm được cắt rời và nuôi cấy in vitro trên 11 môi trường (TS0, TS1, TS2, TS3, TS4, TS5, TS6, TS7, TS8, TS9, TS10).

Thực hiện 8 mẫu/bình, 2 bình/nghiệm thức.

Theo dõi và ghi nhận khả năng tái sinh của mẫu sau 8 tuần cấy chuyển. (mẫu được cấy chuyền sang môi trường mới sau 4 tuần).

2.3.3. Phương pháp khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycine.  Nguyên tắc  Nguyên tắc

Hygromycin - là loại kháng sinh phổ biến aminoglycosidic được tổng hợp từ

vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus, được dùng để chọn lọc các thể chuyển gen có mang gen kháng kháng sinh – gen hpt. Hygromycin ức chế các tế bào khác thông qua việc bất hoạt quá trình sinh tổng hợp protein. Đối với những tế bào mang gen hpt,

các tế bào này sẽ sản sinh ra enzyme kinase ( hygromycin phosphotransferase, HPT), enzyme này sẽ bất hoạt hygromycin thông qua quá trình phosphate hóa.

Hygromycin không bền với điều kiện bên ngoài, bị phân hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ. Vì thế, quá trình chọn lọc hygromycin chỉ diễn ra từ 2-3 tuần. Sau đó, môi trường chọn lọc cần đựơc thay mới. [9,17, 29]

 Mục tiêu

Khảo sát khả năng chống chịu của mô sẹo tử diệp cẩm chướng chưa chuyển gen đối với kháng sinh hygromycin, nhằm phục vụ cho quá trình chọn lọc mô sẹo được chuyển gen sau này.

 Tiến hành

Mẫu tử diệp được cấy lên môi trường tái sinh với nồng độ kháng sinh hygromycin tăng dần 0mg/l; 4mg/l; 8mg/l; 12mg/l; 16mg/l; 20mg/l.

Thực hiện 8 mẫu/bình, 2 bình/nghiệm thức.

Ghi nhận ảnh hưởng của mẫu tử diệp sau 1 đến 4 tuần.