C Thời gian Số chu kỳ
3.6.Kết quả chế tạo thang alen dạng phức hợp 05 locus
Sau khi chế tạo đƣợc các thang alen đơn, pha loãng sản phẩm PCR của các thang alen đơn và trộn với nhau để tạo thành khuôn ban đầu để thực hiện phản ứng PCR nhân bội đồng thời 05 locus. Nồng độ pha loãng của mỗi thang alen đơn chúng tôi thực hiện đồng thời cho cả 05 thang alen đơn là 1/5000. Để nhân bội đƣợc thang alen phức hợp 05 locus trong cùng một phản ứng, chúng tôi sử dụng kết quả tối ƣu thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt đƣợc thực hiện trong đề tài cấp Nhà nƣớc. Các thang alen đƣợc trộn theo tỷ lệ khuôn D3S1358: TH01: D21S11: D18S51: Penta E là 1: 1: 1: 1: 1
Kết quả chế tạo thang alen phức nhƣ sau:
Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 LD LD K562
Thang alen phức hợp sau khi nhân bội đƣợc điện di cùng mẫu sản phẩm nhân bội sử dụng khuôn ADN chuẩn K562 và một số mẫu khuôn khác. Kết quả cho thấy, thang alen có thể sử dụng để định danh đƣợc kiểu gen của các mẫu. Bên cạnh đó, theo tỷ lệ trộn mẫu D3S1358: TH01: D21S11: D18S51: Penta E là 1: 1: 1: 1: 1, chúng tôi nhận thấy các thang alen thành phần chƣa có sự tƣơng đồng. Hình ảnh cho thấy, thang alen D21S11 đậm nhất, sau đó đến thang alen D18S51, thang alen Penta E và D3S1358 tƣơng đƣơng nhau còn thang TH01 cho hình ảnh mờ hơn so với các thang alen còn lại.
Do đó, chúng tôi điều chỉnh tỷ lệ trộn khuôn (thang alen đơn)
D3S1358: TH01: D21S11: D18S51: Penta E ban đầu từ 1: 1: 1: 1: 1 thành 2: 4: 1: 2: 3 sử dụng cho phản ứng PCR, chúng tôi thu đƣợc kết quả điện di nhƣ sau: Hình 26. Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 LD LD K562
Sau khi điều chỉnh lại tỷ lệ trộn thang alen đơn làm khuôn nhân bội tạo thang alen phức 05 locus, chúng tôi thu đƣợc thang alen phức rõ nét, có sự tƣơng đồng giữa các locus và có thể sử dụng đƣợc trong phân tích xác định kiểu gen của mẫu khuôn ADN khác.
Tiến hành nhân bội thang alen nhiều cấp theo phƣơng pháp đã trình bày, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Hình 27. Kết quả chế tạo thang alen phức 05 locus các thế hệ LD: Thang alen phức thế hệ I
LD 1/1000, 1/5000, 1/10000: Thang alen phức các thế hệ I, II, III
D18S51 D21S11 D21S11 TH01 D3S1358 LD LD LD LD 1/1000 1/5000 1/10000 K562 Penta E
Từ kết quả trên, khi sử dụng các nồng độ pha loãng khuôn ADN khác nhau (1000, 5000 và 10.000 lần) để tiến hành PCR tạo thang các thế hệ I, II, III đều cho kết quả giống nhau, không có sự khác biệt. Do đó, từ nồng độ này có thể tiếp tục pha loãng để nhân bội thang alen. Trƣờng hợp thang alen trong thời gian bảo quản lâu dài có ảnh hƣởng đến chất lƣợng, sử dụng bộ KIT Wizard®SV Gel and PCR clean-up System của hãng Promega để tinh sạch lại sản phẩm PCR và sử dụng làm khuôn cho nhân bội tiếp.
Thử nghiệm dùng thang alen đã chế tạo để phân tích kiểu gen một số mẫu cá thể ngƣời, chúng tôi thu đƣợc hình ảnh phân tích nhƣ sau:
Hình 28. Kết quả thử nghiệm sử dụng thang alen phức cho phân tích
D18S51 D21S11 D21S11 TH01 D3S1358 LD LD LD LD LD LD Penta E 101 103 105 107 109 111 113 115 K562 102 104 106 108 110 112 114 116
Với kết quả khảo sát thử nghiệm nhƣ trên, thang alen phức 05 locus D3S1358 – TH01 – D21S11 – D1851 – Penta E đã đƣợc chế tạo hoàn toàn có thể sử dụng để phân tích xác định đƣợc kiểu gen của các mẫu cá thể ngƣời. Thang alen có thể sử dụng đƣợc trong các nghiên cứu và trong ứng dụng phân tích cá thể nhƣ trong lĩnh vực khoa học hình sự và giải quyết nhu cầu dân sinh nhƣ xác định huyết thống.
Hình 29. Kết quả thử nghiệm sử dụng thang alen phức cho phân tích LD: Thang alen phức đƣợc chế tạo trong nghiên cứu
K562: Mẫu chuẩn - Giếng 117-126: Các mẫu nhân bội 05 locus
D18S51 D21S11 D21S11 TH01 D3S1358 Penta E LD LD LD LD 117 118 120 122 124 126 K562 119 121 123 125
CHƢƠNG 4