Phương pháp nghiên cứu

Chọn mẫu thẻ FTA đã được lưu giữ và bảo quản

Mồi huỳnh quang đã được lựa chọn

Tách chiết mẫu bằng Chelex

PCR

Định lượng các mẫu khuôn ADN

Điện di acrylamide

Điện di Agarose kiểm tra sản phẩm PCR

Chọn sản phẩm PCR mang alen

Tinh sạch sản phẩm PCR

Phối trộn tạo thang alen đơn

Phối trộn tạo thang alen phức

Nhân bội thang alen nhiều cấp

Kiểm tra tỷ lệ phối trộn

Kiểm tra tỷ lệ phối trộn Định lượng sản phẩm PCR

2.2.1. Phương pháp tách chiết ADN

Quá trình tách chiết ADN từ cỏc mẫu mỏu thu đƣợc trên thẻ bảo quản bằng Chelex bao gồm cỏc bước:

 Lấy 1/4 vòng tròn vết máu trên thẻ cắt nhỏ cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng;

 Bổ sung 1ml đệm PBS hoặc nước khử ion vô trùng;

 Vortex mạnh; ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút;

 Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch và thu phần cặn giấy;

 Lặp lại 2 lần để loại bỏ hết huyết sắc tố của hồng cầu, các protein đã

biến tính và các tạp chất;

 Bổ sung 200 l dung dịch chelex 5%;

 ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 560C khoảng 30 phút;

 Vortex mạnh 10 giây và ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 1000C trong 8 phút;

 Vortex mạnh 30 giây. Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút;

 Hút phần dịch trên chứa ADN cho sang ống eppendorf 0,5 ml mới;

 Bảo quản ở -200C hoặc có thể sử dụng ngay cho các phản ứng PCR.

2.2.2. Phương pháp định lượng ADN

Tại phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng máy quang phổ kế NanoDrop của hãng ThermoScientific để định lƣợng và kiểm tra đụ̣ tinh sạch của khuụn ADN sau tách chiết. Các bước tiến hành đo như sau:

 Bật máy, chờ máy khởi động.

 Lựa chọn chế độ đo ssDNA (single strain DNA).

 Hiệu chỉnh: Hút 2l nuclease free water hoặc nước khử ion vô trùng hoặc đệm pha loãng khuôn ADN bơm lên mắt đọc, đóng cánh tay của máy xuống, nhấn nút hiệu chỉnh (nút Blank).

 Sau khi hiệu chỉnh bằng mẫu nước hoặc đệm, tiến hành đo đo mẫu:

- Dùng giấy mềm lau mắt đọc, hút 2l mẫu khuôn ADN cần định lƣợng và bơm lên mắt đọc, đóng canh tay của máy xuống, nhấn nút đo mẫu (Measure).

- Kết quả đƣợc hiển thị trong bảng với các thông số: Tên mẫu - Hàm lƣợng ADN (ng/l) - Chỉ số A260nm - Chỉ số A280nm - Chỉ số A260nm/280nm (OD).

- Lưu kết quả đo vào dữ liệu phân tích.

2.2.3. Phương pháp nhân bội ADN

Dựa trên yêu cầu nghiên cứu, chúng tôi sử dụng các cặp mồi đã đƣợc sử dụng tại phòng thí nghiệm Công nghệ Gen và Vi sinh (P3 – Viện H57 – Tổng cục IV – Bộ Công an). Bộ mồi 05 locus STR Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 đáp ứng các yêu cầu tương thích, có hiệu suất cao, cho phép nhân bội đồng thời cả năm locus trong cùng một phản ứng PCR.

Chất huỳnh quang Fluorescein đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu vì đây là

chất huỳnh quang đƣợc sử dụng ở hầu hết các máy scanner và thiết bị giải trình tự tự động khác nhƣ FMBIO (Hitachi), Pharos FX plus (Bio-rad), ABI PRISMđ Genetic Analyzer (Applied Bio System), ngoài ra còn đƣợc sử dụng trong các bộ KIT thương mại khác hiện đang được bán trên thị trường như bộ

KIT Power Plex 16 của Promega.

Kỹ thuật PCR nhân bội ADN đƣợc thực hiện với các điều kiện đã đƣợc tối ƣu tại phòng thí nghiệm, sử dụng chung cho 05 locus trong nghiên cứu nhƣ sau:

Bảng 5. Thành phần phản ứng nhân bội đơn locus

Thành phần PCR Thể tích sử dụng Nồng độ cuối cùng

dNTP 0,25 100 M

Đệm PCR 2,5 1 X

MgCl2 1 1 mM

Mồi F + R 1 + 1 0,3M

Taq – ADN

polymerase 0,3 1,5U

Khuôn ADN 3 10 – 20ng

Nuclease free water - -

Tổng V 25

Chu trình nhiệt sử dụng cho nhân bội các mẫu đơn locus nhƣ sau:

Bảng 6. Chu trình nhiệt nhân bội đơn locus

Nhiệt độ oC Thời gian Số chu kỳ

96 3 phút 1

94 1 phút

30

60 1 phút

72 1,5 phút

60 30 phút 1

4  -

2.2.4. Kỹ thuật điện di ADN

Đề tài sử dụng phương pháp điện di trên gel agarose và gel poly acrylamide.

Điện di trên gel agarose

 Chuẩn bị gel agarose:

- Pha agarose 2% trong 1X TBE và đựng trong bình nón chịu nhiệt.

- Đun nóng cho agarose tan hoàn toàn.

- Để nguội đến 60OC, đổ gel vào khay đã đƣợc lắp lƣợc.

- Rút lƣợc ra sau khi gel đã đông lại (khoảng 1h)

 Chạy điện di:

- Đặt bản gel vào buồng điện di theo phương ngang với dòng điện một chiều, đổ đệm TBE 1X ngập bản gel.

- Trộn mẫu (khuôn ADN hoặc sản phẩm nhân bội) với đệm Glycerol theo tỷ lệ tương ứng 15l khuôn ADN với 5l Đệm và 7l sản phẩm nhân bội với 2l Đệm.

- Cài đặt chế độ chạy điện di nhƣ sau:

 Điện di khuôn ADN: 110V trong 1h30’ đến 2h

 Điện di sản phẩm nhân bội: 110V trong 30 phút.

Điện di trên gel Poly acrylamide

 Chuẩn bị kính:

- Lau khuôn kính trơn bằng dung dịch bôi trơn;

- Lau bản kính dính bằng dung dịch bôi dính;

- Chèn spacer lên khuôn kính trơn để tạo khoảng cách giữa hai khuôn kính; Ghép bản kính dính vào khuôn kính trơn;

- Cố định khuôn bằng giá kẹp hai bên khuôn;

- Lắp lƣợc và lắp chụp đáy cao su để tạo khuôn gel hoàn chỉnh;

- Đặt khuôn gel lên giá và chỉnh cân bằng.

 Chuẩn bị gel

- Pha gel gồm hỗn hợp các dung dịch gel poly acrylamide 6%, APS và

TEMED;

- Dùng xilanh hút dung dịch gel đã pha và bơm vào khuôn gel theo lỗ dưới đáy khuôn;

- Để gel đông trong vòng 1h.

 Chuẩn bị mẫu:

Trộn mẫu với Đệm trộn mẫu theo tỷ lệ 1 mẫu : 1 Đệm

- Biến tính mẫu: Đặt mẫu vào máy gia nhiệt ở 95oC trong 5 phút và cho ngay lên khay đá lạnh.

 Chạy điện di:

- Đặt khuôn gel vào bồn điện di, lặp các điện cực và cắm hai đầu dây điện cực vào nguồn;

- Đặt chế độ để chạy không tải bản gel trong vòng 1h để bản gel đạt nhiệt độ khoảng 45oC;

- Khi bản gel đạt nhiệt độ cần thiết, gỡ nắp khuôn gel, và nạp mẫu vào giếng.

- Sau khi nạp mẫu, lắp lại nắp khuôn gel, đặt chế độ chạy điện di trong vòng 2h30 phút.

- Kết thúc chạy điện di, tháo khuôn gel ra khỏi bồn điện di, nhẹ nhàng tách bản kính dính ra khỏi khuôn kính trơn.

- Đặt bản kính dính (có dính lớp gel poly acrylamide) vào bồn rửa sạch và rửa bằng nước khử ion để loại bỏ đệm dư và cặn bẩn.

2.2.5. Phương pháp phát hiện ADN sau điện di

2.2.5.1. Phát hiện băng ADN bằng Ethidium bromide

Trong nghiên cứu, phương pháp nhuộm Ethidium bromide được sử dụng để kiểm tra khuôn ADN sau tách chiết.

 Quá trình điện di và kiểm tra sản phẩm PCR:

- Gel đƣợc đặt nằm ngang trong buồng điện di có chứa dung dịch đệm;

- Điện di thực hiện theo phương nằm ngang với dòng điện một chiều;

- Quá trình điện di trên gel agarose đƣợc thực hiện với điều kiện;

- Điện áp: 110V;

- Thời gian khoảng 1-2h (đối với các mẫu khuôn ADN tổng số sau tách chiết) và khoảng 20 phút (đối với các mẫu sản phẩm PCR);

- Thể tích mẫu khuôn ADN: 15-20l/ 1 giếng;

- Đặt bản gel sau điện di vào khay chứa Ethidium bromide 10mg/ml.

(Có thể đặt trên máy lắc để tăng hiệu quả nhuộm);

- Sau khi nhuộm, rửa bản gel bằng đệm TBE 1X hoặc nước khử ion;

- Đặt bản gel đã rửa lên hệ thống soi UV; hoặc có thể dử dụng hệ thống scan huỳnh quang Pharos FXTM Plus Molecular Imager với bước sóng sử dụng là 532nm

- Chụp ảnh bản gel trên hệ thống soi để lưu lại hình ảnh.

2.2.5.2. Phát hiện băng ADN bằng kỹ thuật soi gel huỳnh quang

áp dụng phương pháp đánh dấu huỳnh quang sản phẩm PCR thông qua mồi, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR sử dụng mồi gắn chất huỳnh quang FL để nhân bội các mẫu ADN. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra kích thước bằng gel agarose và kiểm tra kiểu gen bằng gel poly acrylamide.

Bản gel được quét bằng nguồn lazer kích thích ở bước sóng 488nm, các băng ADN phát quang sẽ đƣợc hệ thống phân tích ghi nhận và chuyển dữ liệu để phần mềm xử lý. Sử dụng hệ thống máy Pharos FXTM Plus Molecular Imager để phân tích kết quả nghiên cứu sau điện di với các bước tiến hành như sau:

 Sau khi điện di, bản gel được rửa bằng nước khử ion trong vòng 2-3 phút để làm sạch đệm dƣ và các cặn bẩn bám trên gel;

 Đặt bản gel lên khay kính và đặt vào máy Pharos FXTM Plus Molecular Imager;

 Thiết lập chế độ soi gel tương thích với chất huỳnh quang sử dụng cho mồi huỳnh quang (cụ thể là chế độ quét Florophore, bước sóng 488nm);

 Lựa chọn vùng quét cần thiết và quét lazer trên vùng gel đã lựa chọn;

 Sử dụng phần mềm Quantity One để phân tích hình ảnh sau khi quét;

 Lưu lại các ảnh sau khi quét để phân tích.

2.2.6. Phương pháp chế tạo thang alen chỉ thị huỳnh quang

 Chế tạo thang alen đơn

- Tách chiết các mẫu mang alen từ thẻ bảo quản.

- Điện di Agarose kiểm tra khuôn sau tách chiết.

- Đo OD để xác định hàm lƣợng ADN trong các mẫu sau tách chiết.

- Tiến hành PCR nhân bội các mẫu mang alen sử dụng các cặp mồi huỳnh quang.

- Điện di Agarose kiểm tra kết quả PCR.

- Điện di khảo sát sơ bộ một số mẫu trên gel poly acrylamide để lựa chọn các mẫu mang alen phù hợp để chế tạo thang alen.

- Chọn mẫu mang alen cần thiết.

- Tinh sạch sản phẩm PCR, sử dụng bộ KIT “Wizard®SV Gel and PCR clean-up System” của hãng Promega.

- Đo hàm lƣợng sản phẩm PCR để xác định tỷ lệ trộn các mẫu.

- Tạo thang alen hỗn hợp có đầy đủ alen của mỗi locus bằng cách trộn lẫn các alen đã tinh sạch với nhau.

- Sử dụng hỗn hợp sau khi trộn làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR đơn cho mỗi locus, điện di kiểm tra tỷ lệ trộn thang alen thông qua hình ảnh của các băng ADN.

- Sau khi thu đƣợc thang alen có tỷ lệ các băng tốt nhất, tiến hành nhân bội thang alen nhiều cấp.

 Chế tạo thang alen phức



Sau khi chế tạo thang alen đơn, tiến hành trộn các thang alen đơn theo tỷ lệ phù hợp để tạo thang alen phức. Thực hiện phản ứng PCR phức 05 locus trong cùng một phản ứng để nhân bội đồng thời thang alen của 05 locus nghiên cứu.

Bảng 7. Thành phần phản ứng nhân bội phức hợp 05 locus

Thành phần PCR Thể tích sử dụng Nồng độ cuối cùng

dNTP 0,5 200 M

Đệm PCR 3 1,2 X

MgCl2 1,5 1,5mM

Mồi 05 locus

(Primer Mix ) 5 0,3 M each

Gold Taq – ADN

polymerase 0,6 3U

BSA (20mg/ml) 0.2 160 ng/ l

Khuôn ADN - 20 ng

Nuclease free water - -

Tổng V 25

Bảng 8. Chu trình nhiệt nhân bội phức hợp 05 locus

Nhiệt độ OC Thời gian Số chu kỳ

95 11 min 1

94 1 min

30

56 1 min

72 1 min

60 80 min 1

4 ∞ -

Sau khi thu đƣợc thang alen phức hợp hoàn chỉnh (đã đƣợc kiểm tra qua quá trình điện di và scan trên hệ thống máy Pharos, có chất lƣợng phù hợp với yêu cầu nghiên cứu), thực hiện nhân bội nhiều cấp để thu đƣợc số lượng lớn thang alen phục vụ nghiên cứu khác. Phương pháp nhân bội thang alen nhiều cấp đƣợc thực hiện với khuôn đầu vào là sản phẩm PCR của lần nhân bội trước được pha loãng.

Phương pháp nhân bội thang alen nhiều cấp bao gồm các bước sau:

 Pha loãng sản phẩm PCR thành các nồng độ thấp hơn gồm 1/100, 1/500, 1/1000;

 Sử dụng sản phẩm PCR sau pha loãng làm khuôn PCR;

 Kiểm tra thang alen của mỗi nồng độ khuôn pha loãng tương ứng;

 Lựa chọn nồng độ pha loãng thích hợp để thực hiện nhân bội lấy sản phẩm phục vụ các nghiên cứu khác.

* Các bước tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ KIT “Wizard®SV Gel and PCR clean-up System”

 Chuẩn bị mẫu

Sau khi thu đƣợc sản phẩm PCR (đã kiểm tra kết quả), bổ sung 1V dung dịch Membrane Binding Solution vào ống PCR. Vortex mạnh để mẫu trộn đều với Membrane Binding Solution.

 Liên kết sản phẩm PCR với màng liên kết

- Chèn SV MiniColumn vào ống thu mẫu (Collection Tube) kèm theo KIT.

- Chuyển sản phầm PCR đã chuẩn bị trên vào SV MiniColumn.

- ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Ly tâm 14.000 v/p trong 1 phút.

- Loại bỏ dịch, chèn SV MiniColumn ống thu mẫu khác.

 Rửa màng liên kết

- Thêm 700ul Membrane Wash Solution vào SV MiniColumn.

- ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Ly tâm 14.000 v/p trong 1 phút.

- Loại bỏ dịch, chèn SV MiniColumn ống thu mẫu khác.

- Lặp lại bước trên với 500ul Membrane Wash Solution.

- Ly tâm 14.000v/p trong 5 phút.

- Ly tâm lại trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn ethanol dƣ thừa.

 Hoà tan sản phẩm PCR

- Chuyển SV MiniColumn vào ống sạch.

- Thêm 50l nước khử ion vô trùng.

- ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Ly tâm 14.000 v/p trong 1 phút.

- Loại bỏ Column và bảo quản dịch thu đƣợc ở -20oC.

2.2.7. Thu thập và xử lý dữ liệu

Thang alen hoàn chỉnh là thang alen có đầy đủ các alen có thể thu thập đƣợc trong quá trình khảo sát các mẫu nghiên cứu. Khi điện di cùng các mẫu cá thể người, yêu cầu quan trọng nhất của thang alen thu được là phải định danh được alen của các mẫu cá thể người đó. Tức là trên điện di đồ, các alen (các băng ADN) của mẫu nghiên cứu phải trùng với các băng tương ứng của thang alen.

Để thu thập các alen, trên điện di đồ của từng locus, chúng tôi lựa chọn các mẫu mang các alen khác nhau, thể hiện trên hình ảnh các băng ADN, sao cho thu đƣợc nhiều alen nhất có thể có.

Để kiểm tra thang alen, chúng tôi tiến hành điện di thang với những mẫu đã lựa chọn cho chế tạo thang. Thang alen chuẩn phải có các băng tương ứng với các băng của mẫu.

Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng mẫu khuôn K562 (đã biết các alen của tất cả locus theo quy ƣớc quốc tế) để trộn cùng với những mẫu đã đƣợc lựa chọn khác trong quá trình chế tạo thang alen. Mục đích sử dụng mẫu K562 là để tạm thời định danh các alen của thang theo tiêu chuẩn quốc tế.

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN