1.4.1. Khái niệm về chất huỳnh quang
Huỳnh quang là hiện tƣợng phát xạ ánh sáng bức xạ điện từ của một chất có hấp thụ bức xạ của bước sóng khác nhau. Trong hầu hết trường hợp, hấp thụ ánh sáng của một bước sóng nhất định gây ra sự phát xạ của ánh sáng với bước sóng dài hơn (và năng lượng thấp hơn). Tuy nhiên, tại điều kiện bức xạ cao đang đƣợc hấp thụ, có thể cho một điện tử hấp thụ hai photon (hấp thụ nhiều photon) và có thể dẫn đến sự phát xạ của bức xạ có bước sóng nhỏ hơn so với các nguồn kích thích. Sự khác biệt giữa năng lƣợng đƣợc hấp thụ và
phát ra lƣợng tử ánh sáng do tổn thất nhiệt. Ứng dụng thực tế của hiệu ứng này đƣợc tìm thấy trong khoáng vật, cảm biến hóa học, đánh dấu huỳnh quang, thuốc nhuộm, máy dò sinh học… Thuật ngữ “huỳnh quang” – fluorescent, đƣợc đặt bởi George Gabriel Stokes trong bài báo năm 1852, tên chính nó đƣợc bắt nguồn từ fluorit khoáng (canxi difluoride). Vậy chất huỳnh quang đƣợc hiểu là những chất mà phân tử của nó có khả năng phát huỳnh quang.
Các phép đo sự phát quang bắt nguồn từ sự kích thích một phân tử thuốc nhuộm, sau đó thuốc nhuộm đƣợc kích thích phát sáng và đƣợc đọc dưới thiết bị chuyên dụng. Một phân tử có khả năng phát huỳnh quang được
gọi là một Fluorophore. Các Fluorophore khác nhau về hình dạng, kích thước và khả năng phát quang, các Fluorophore đƣợc sử dụng chủ yếu trong đánh dấu ADN là nó có khả năng phát quang trong vùng quan sát của quang phổ (phạm vi phát sáng khoảng 400nm – 600nm).
Quỏ trỡnh phỏt quang miờu tả rừ trong hỡnh 4. Bước đầu tiờn, mụ̣t photon (Hvex) từ nguồn laser kích thích điện tử từ vùng năng lƣợng cơ sở (S0) đến vùng dịch chuyển kích thích (S’1). Điện tử này sau đó thay đổi hình dạng và tương tác với môi trường của nó dẫn đến trạng thái kích thích (S1). Bước cuối cùng, một photon (Hvem) đƣợc phát sáng tại mức năng lƣợng thấp hơn khi các điện tử được kích thích trở lại trạng thái cơ sở. Vì năng lượng và bước sóng có quan hệ thuận nghịch với nhau, photon phát sáng có bước sóng cao hơn photon kích thích. Sự khác biệt giữa các đỉnh hấp thụ và quang phổ phát xạ gọi là dịch chuyển Stokes [9, 25]. Thay đổi này cho phép sử dụng các bộ
lọc quang học phù hợp để phân chia ánh sáng từ nguồn ánh sáng phát ra. Đặc tính hấp thụ ánh sáng và phát quang của Fluorophore phụ thuộc vào cấu trúc hóa học của nó và điều kiện môi trường, nên nếu chọn lọc cẩn thận các bộ lọc quang học khác nhau, có thể lựa chọn đƣợc phổ phát sáng của các Fluorophore với các phin lọc khác nhau.
Hình 2. Quá trình phát huỳnh quang a) Các bước chuyển năng lượng b) Bước chuyển phát huỳnh quang
Ưu điểm lớn nhất của phương pháp đánh dấu huỳnh quang đó là khả năng sử dụng nhiều Fluorophore để đọc nhiều trình tự ADN khác nhau trong cùng một phản ứng, tỉ lệ đọc mẫu của phức hợp nhiều loại Fluorophore cao hơn nhiều so với việc phân tích sử dụng đơn Fluorophores. Có một số yếu tố ảnh hưởng đến mức phát huỳnh quang của các Fluorophores cần lưu ý là:
Phân tử gam hệ số dập tắt: khả năng thuốc nhuộm hấp thụ ánh sáng.
Năng suất lƣợng tử: hiệu suất Fluorophores đƣợc kích thích chuyển đổi hấp thu ánh sáng phát sáng.
Ổn định ánh sáng: khả năng tồn tại lâu bền trong trường kích thích khi thuốc nhuộm trải qua các chu kì kích thích và phát sáng mà không bị phá hủy, hoặc trải qua tẩy trắng ảnh.
Môi trường nhuộm: các yếu tố có ảnh hưởng đến mức độ phát huỳnh quang bao gồm độ pH, nhiệt độ, dung môi, và sự hiện diện của một số chất ức chế nhƣ hemoglobin.
Hiệu quả phát huỳnh quang tổng thể của một phân tử thuốc nhuộm phụ thuộc vào sự kết hợp của bốn yếu tố trên. Thực tế cho thấy độ sáng của một Fluorophore tỉ lệ thuận với hệ số dập tắt và năng suất lƣợng tử[21].
1.4.2. Ứng dụng chất huỳnh quang trong phân tích ADN
Hiện nay, hầu như tất cả các bộ KIT STR thương mại đều có sử dụng mồi đánh dấu huỳnh quang. Bảng 5 tổng kết một số thuốc nhuộm huỳnh quang thường được sử dụng để đánh dấu sản phẩm PCR. Các tên hóa chất đối với thuốc nhuộm được sắp xếp theo bước sóng kích thích và phát xạ của chúng.
Bảng 3. Đặc trƣng của một số thuốc nhuộm huỳnh quang sử dụng trong các bộ KIT phân tích STR thương mại
Thuốc nhuộm Tên hóa học Ánh sáng kích
thích cực đại (nm)
Ánh sáng phát ra cực đại
(nm)
5-FAM 5- carboxy fluorescein 493 522
JOE 6- carboxy-2’,7’-dim eoxy-4’,5’-
dichl orofluor escein 528 554
VIC Độc quyền của Applied Biosystems 538 554
NED Độc quyền của Applied Biosystems 546 575
PET Độc quyền của Applied Biosystems 558 595
LIZ Độc quyền của Applied Biosystems 638 655
ROX (CXR) 6-carboxy-X-rhodamine 587 607
Fluorescein (FL) Fluorescein 490 520
TMR (TAMRA) N,N,N’,N’-tetramethyl-6
carboxyfluorescein 560 583
TET 4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-
carboxyfluorescein 522 538
HEX 4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-
carboxyfluorescein 535 553
Rhodamine Red Rhodamine Red™-X
(Molecular Probes) 580 590
Texas Red Texas Red®-X (Molecular Probes) 595 615 SYBR Green
(intercalator) Độc quyền của Molecular Probes 497 520
Mỗi bộ thuốc nhuộm huỳnh quang đƣợc sử dụng phải phù hợp với các thiết bị quang học, nguồn kích thích đi kèm. Vì vậy, không linh động nhƣ phương pháp nhuộm bạc, các bộ KIT phân tích STR sử dụng mồi gắn huỳnh quang có yêu cầu chặt chẽ về các thiết bị sử dụng đi kèm hơn.
1.5. Tình hình nghiên cứu chế tạo thang alen chỉ thị huỳnh quang