Nguyên liệu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tƣợng nghiên cứu sử dụng trong đề tài bao gồm các mẫu máu (khoảng 50 mẫu), 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358.

Mẫu máu đƣợc thu bằng cách sử dụng xilanh hút và bơm lên trên bề mặt lớp giấy thấm có tẩm sẵn hóa chất bảo quản (EDTA, Tris-base...)

Chúng tôi sử dụng mẫu khuôn chuẩn K562 của hãng Promega để làm mẫu đối chứng dƣơng trong các thí nghiệm và để xác định các alen của thang alen sau khi chế tạo hoàn chỉnh.. Mẫu khuôn K562 có hàm lƣợng 10ng/µl, có độ tính sạch cao, có kiểu gen đã đƣợc xác định ở tất cả các locus, kể cả 05 locus sử dụng trong nghiên cứu.

2.1.2. Thiết bị, vật tư nghiên cứu

- Các máy móc cần thiết cho pha hóa chất, Tách chiết, PCR và điện di. - Hệ thống điện di Sequi-Gen GT Nucleic Acid Electrophoresis Cell

38 x 50cm

- Hệ thống scan huỳnh quang Pharos FXTM

Plus Molecular Imager. - Micropipette các loại: 1-10 l, 10 -100 l, 20- 200 l, 100 - 1000 l. - ống eppendorf chuyên dùng cho PCR các loại: 1,5 ml; 0,5 ml và 0,2

ml.

- Đầu tip các loại: 10 l, 200 l, 1000 l và đầu tip có lọc 200 l.

2.1.3. Mồi cho cá c locus nghiên cứu

Trong đề tài , chúng tôi sử dụng các bộ mồi cho 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 đã đƣợc nghiên cứu áp dụng tại Phòng thí nghiệm Công nghê ̣ Gen và Vi sinh (P3 - Viện H57 - Tổng cục IV - Bộ

Công an) và đƣợc tổng hợp gắn chất huỳnh quang Fluorescein (FL) bở i mô ̣t hãng IDT (Mỹ).

B¶ng 4. Trình tự mồi trong nghiên cứu

TT Primer Trình tự mồi

1 D3-1 5'- ACT GCA GTC CAA TCT GGG T -3'

2 D3-2 5'-[FL]-ATG AAA TCA ACA GAG GCT TGC -3'

3 TH-1 5'-[FL]-GTG ATT CCC ATT GGC CTG TTC -3'

4 TH-2 5'- ATT CCT GTG GGC TGA AAA GCT C -3'

5 D21-1 5'- ATA TGT GAG TCA ATT CCC CAA G-3'

6 D21-2 5'-[FL]-TGT ATT AGT CAA TGT TCT CCA GAG AC -3'

7 D18-1 5'-[FL]-TTC TTG AGC CCA GAA GGT TA -3'

8 D18-2 5'-ATT CTA CCA GCA ACA ACA CAA ATA AAC -3'

9 Penta E-1 5'-ATT ACC AAC ATG AAA GGG TAC CAA TA -3'

10 Penta E-2 5'-[FL]-TGGGTTATTAATTGAGAAAACTC CTTACAA TTT-3'

2.1.4. Hoá chất

 Hóa chất tách chiết ADN

- PBS: 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10 mM Na2HPO4; 2 mM KH2PO4.

- Chelex 5% : Cân 5g Chelex 100 (Sigma - Mỹ), định mức bằng nƣớc khử ion vô trùng đến 100ml. Lắc đều mỗi khi sử dụng

 Hoá chất dùng cho PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

- Đệm 10X PCR; 25 mM MgCl2; Taq ADN polymerase (5unit/l); dNTP (Promega);

- Mồi gắn huỳnh quang của 05 locus gen nghiên cứu: Penta E, D18S51; D18S51 và D21S11.

- Nƣớc PCR: nƣớc cất 2 lần khử ion bằng máy MilliQ, sau đó hấp tiệt trùng ở (121oC; 1 at; 20 phút).

 Hoá chất dùng cho điện di

- Đệm TBE 5X:Hòa tan 54g Tris-base trong 500ml, bổ sung 27,4g acid boric và 20ml EDTA 0,5M, pH8. Sau khi các hóa chất tan hoàn toàn, định mức bằng nƣớc khử ion đến 1000ml. Bảo quản dung dịch ở 4o

- Agarose 1,5%: Cân 1,5g agarose, định mức bằng TBE 1X đến 100ml.

- Dung dịch gel poly acrylamide 6%, Urea 7M: Cân 420g urea, hòa tan trong 300ml nƣớc khử ion. Bổ sung 57g acrylamide và 3g bis-acrylamide, hòa tan hoàn toàn và định mức đến 1000ml. Bảo quản dung dịch ở 4o

- APS 10%: Hòa tan 1g APS trong 10ml nƣớc khử ion, Bảo quản dung dịch ở 4o

- TEMED

- Đệm trộn mẫu Formalmide: Chuẩn bị 95ml Formalmide, bổ sung 0,05g Bromophenol Blue, hòa tan hoàn toàn và định mức bằng NaOH 10mM đến 100ml. Bảo quản đệm ở 4o

- Đệm trộn mẫu Glycerol: Chuẩn bị 30ml Glycerol, bổ sung 0,05 g Bromophenol Blue và 0,05 g Cylen Xyanol FF và định mức đến 100ml bằng nƣớc khử ion. Lắc đều cho các hóa chất tan hoàn toàn và bảo quản ở 4oC.

- Ethidium Bromide 1 mg/ml: .Bổ sung 5ml nƣớc khử ion vào lọ Ethidium Bromide 1g (Merck). Lắc tan hoá chất. Lấy 1ml pha trong 199ml đệm TBE 1X. Bảo quản dung dịch trong chai thủy tinh tối màu và tránh ánh sáng.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Chọn mẫu thẻ FTA đã được

Mục lục