Budowle et al (1991) là nhóm tác giả đầu tiên công bố bản miêu tả thang alen. Phương pháp này mô tả sự trộn lẫn các alen đã được nhân bội của locus D1S80 từ một số cá thể nhằm tạo một maker kích thước đơn giản để phân tích mẫu nhân bội cùng locus, mẫu và maker đƣợc nhận biết bằng kỹ
thuật điện di và sử dụng phương pháp nhuộm bạc. Sau đó, các tác giả khác cũng công bố các quy trình chế tạo thang alen tương tự Budowle, nhưng sử dụng kỹ thuật điện di phân tách trên gel poly acrylamide và nhận biết các alen phân tách bằng mồi huỳnh quang sử dụng các đầu đọc huỳnh quang để ghi nhận hình ảnh [20, 33].
Từ những năm đầu thập niên 90 thế kỷ XX, hai hãng thương mại nổi tiếng sản xuất chế phẩm sinh học là Perkin Elmer và Promega (Mỹ) đã sản xuất nhiều bộ KIT phân tích ADN khác nhau. Các bộ KIT thương phẩm như trên thường được gắn một số chất huỳnh quang, sản phẩm PCR (là các đoạn ADN tương ứng với loại alen) được phát hiện bằng các máy giải trình tự như:
ABI prism 377 DNA Sequencer, ABI prism 310 DNA Sequencer…. Mỗi bộ KIT phân tích ADN đối với từng locus bao gồm:
- PCR mix bao gồm các thành phần để thực hiện PCR với cặp mồi tương ứng đặc hiệu đã thiết kế (PCR mix có thể cho 1 locus hoặc nhiều locus trong 1 phản ứng).
- Thang chỉ thị alen (allelic ladder) bao gồm toàn bộ alen của locus cần phân tích. Thang alen chỉ thị để định danh alen khi điện di.
Trình tự mồi và thang chỉ thị alen thuộc bản quyền của hãng sản xuất, chúng đƣợc giữ bí mật và đƣợc bán kèm với bộ KIT khuếch đại PCR.
Sử dụng các bộ KIT phân tích cá thể, trên thế giới có hàng triệu các phân tích STR đƣợc tiến hành hàng năm tại các viện nghiên cứu trực thuộc chính phủ, các trường đại học, các phòng xét nghiệm tư nhân... phục vụ các ứng dụng rất đa dạng của nhận dạng cá thể người, bao gồm xây dựng các cơ sở dữ liệu DNA cho ngành khoa học hình sự (DNA databasing forensic casework), tìm kiếm người mất tích, so sánh nhận dạng nạn nhân của các vụ thảm hoạ hoặc các xét nghiệm huyết thống.
Ở Việt Nam, trong khoảng 10 năm trở lại đây việc ứng dụng các kỹ thuật phân tích chỉ thị ADN trong xác định cá thể người và huyết thống đã có nhiều bước phát triển và thành tựu. Tại trung tâm công nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội [13, 17], các tác giả đã nghiên cứu việc sử dụng xét nghiệm chỉ thị phân tử dựa trên PCR để nghiên cứu tần suất alen của hai locus D1S80 và D17S5, đồng thời với các nghiên cứu về locus gen đa hình nằm trên NST giới tính Y. Các nghiên cứu của trường Đại học Y Hà Nội tập trung vào việc xác định giới tính thai nhi, xác định các bệnh di truyền liên quan đến giới tính.
Năm 1999, Viện khoa học hình sự - Bộ Công an đã ứng dụng và xây dựng đƣợc bảng tần suất alen của 9 locus gen[11, 14]. Các công trình nghiên cứu này đến nay vẫn được tiếp tục theo hướng hoàn thiện công nghệ từ tách chiết, định lượng ADN, PCR... để tìm ra những đặc thù của hệ gen người Việt và các dân tộc khác phục vụ cho công tác giám định.
Theo hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích gen phục vụ chẩn đoán hình sự, Viện kỹ thuật Hoá sinh và Tài liệu nghiệp vụ - Bộ Công an đã
nghiên cứu chế tạo các bộ KIT phân tích gen để thay thế các sản phẩm nhập ngoại, mục đích chủ động đƣợc công nghệ, hạ giá thành phân tích và có thể chuyển giao kỹ thuật cho các địa phương.
Tuy nhiên, việc nghiên cứu công nghệ phân tích STR sử dụng các cặp mồi huỳnh quang trong chế tạo thang alen chỉ thị tại Việt Nam chƣa có một cơ sở nghiên cứu nào tiến hành. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang với mục đích nâng cao năng lực phân tích cho các phòng thí nghiệm ở địa phương có nhu cầu. Nội dung nghiên cứu gồm có:
1. Tách chiết, định lƣợng ADN trong các mẫu nghiên cứu.
2. Nhân bội và kiểm tra sản phẩm PCR để thu nhận mẫu sử dụng cho chế tạo thang alen
3. Chế tạo thang alen đơn cho mỗi locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358
4. Chế tạo thang alen phức hợp 05 locus trong cùng một phản ứng PCR.
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU