Tất cả dữ liệu đƣợc biểu diễn dƣới dạng trung bình ± sai số chuẩn (M ± SD). Dùng phép kiểm t-test và Anova một chiều, một yếu tố với phần mềm Minitab 15.0 để thống kê dữ liệu. Vẽ đồ thị bằng chƣơng trình Microsoft Excel 2007.
39
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Tiêu chuẩn bột sấy phun đài hoa Bụp giấm 3.1.1. Kiểm tra độ màu bằng phƣơng pháp đo quang 3.1.1. Kiểm tra độ màu bằng phƣơng pháp đo quang
Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra độ màu bằng phƣơng pháp đo quang của BSP Bƣớc sóng (nm) Độ hấp thu (lần 1) Độ hấp thu (lần 2) Độ hấp thu (lần 3) Độ hấp thu (trung bình) Nhận xét 523 410 410 410 410 Đạt 412 150 150 150 150 Đạt 605 20 20 20 20 Đạt
Dịch lọc đƣợc đo độ hấp thu 3 lần theo các bƣớc sóng, mỗi lần đo cách nhau 15 phút. Dung dịch đo có độ màu ổn định trong thời gian 45 phút (3 lần đo).
Quy trình kiểm tra độ màu đã đƣợc xây dựng và cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu và sản xuất dƣợc liệu Miền Trung.
3.1.2. Định lƣợng anthocyanin bằng phƣơng pháp đo quang
Hàm lƣợng anthocyanin trong BSP đạt 0,215%.
Định lƣợng anthocyanin toàn phần bằng phƣơng pháp đo quang theo quy trình và tiêu chuẩn cơ sở của Trung tâm nghiên cứu và sản xuất dƣợc liệu Miền Trung.
3.1.3. Độ ẩm
Bảng 3.2. Kết quả độ ẩm của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm
Độ ẩm Trung bình
Lần 1 2,82
2,83% ± 0,02
Lần 2 2,85
Lần 3 2,83
40
3.1.4. Tro toàn phần
Bảng 3.3. Kết quả tro toàn phần của đài hoa Bụp giấm
Tro toàn phần (%) Trung bình
Lần 1 0,13
0,123% ± 0,01
Lần 2 0,12
Lần 3 0,12
Kết luận: Độ tro toàn phần của bột sấy phun đạt tiêu chuẩn cơ sở.
3.1.5. Kim loại nặng
Kim loại nặng < 10 ppm (asen, cadimi, chì, thủy ngân).
Xác định lƣợng kim loại nặng theo phƣơng pháp quy định trong DĐVN IV, quy trình đƣợc thực hiện bởi Trung tâm nghiên cứu và sản xuất dƣợc liệu Miền Trung Bảng 3.4. Kết quả khảo sát bột sấy phun đài hoa Bụp giấm
TT Chỉ tiêu Yêu cầu Kết quả
1 Kiểm tra độ màu
Ở bƣớc sóng 523 nm, trị số phải > 400 (đây là trị số chính để xác định độ màu của BSP), ở bƣớc sóng 412 nm, trị số phải từ 100 – 200 và ở bƣớc sóng 605 nm, trị số phải < 30. Đạt 2 Độ ẩm < 5% 2,83% 3 Độ tro toàn phần < 5% 0,123%
4 Kim loại nặng* < 10 ppm (asen, cadimi, chì, thủy ngân) Đạt
5 Định lƣợng anthocyanin toàn phần *
> 0,18% 0,215%
41
Bàn luận
BSP từ đài hoa Bụp giấm đạt một số tiêu chuẩn chất lƣợng cần thiết cho một nguyên liệu có nguồn gốc từ dƣợc liệu nhƣ độ ẩm, độ tro, kim loại nặng, định lƣợng đây là cơ sở để sử dụng nguyên liệu này cho những nghiên cứu kế tiếp.
3.2. Độc tính cấp của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm
Thử độc tính cấp với bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm, liều tối đa có thể bơm qua kim của BSP là 8,9 g/10 ml.
Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm độc tính cấp của BSP
Lô thử Liều dùng (g/kg chuột) Số chuột Số chuột chết
trong lô Phân suất tử vong
1 3 6 0 0
2 6 6 0 0
3 8,9 6 0 0
Nhận xét
Trong suốt thời gian 72 giờ đầu tiên và 2 tuần quan sát tiếp theo, không ghi nhận đƣợc bất kỳ dấu hiệu bất thƣờng nào xảy ra trên chuột thử nghiệm. Tất cả các chuột đều ăn uống và hoạt động bình thƣờng, không có chuột chết. Do đó, không tìm đƣợc LD50 vì lô chuột uống 8,9 g/kg là liều tối đa thuốc phân tán vào nƣớc có thể qua kim để cho uống đƣợc mà vẫn không có chuột chết.
Quan sát đại thể
Sau 2 tuần theo dõi, mổ chuột ở tất cả các lô để quan sát đại thể các phủ tạng của chuột. Kết quả: Tất cả các chuột thực nghiệm không thấy bất kỳ thay đổi bệnh lý nào về hình thái đại thể của các cơ quan tim, gan, thận, bàng quang và hệ thống tiêu hóa.
Nhận xét
Trong thử nghiệm độc tính cấp, liều cao nhất của BSP có thể cho chuột uống là 8,9 g/kg chuột. Ở liều này, thuốc ở dạng hỗn dịch rất đậm đặc vừa đủ qua đầu kim để có
42
thể bơm thuốc vào dạ dày chuột. Theo dõi trong suốt 72 giờ đầu và 2 tuần tiếp theo sau khi chuột uống, nhận thấy chuột ở tất cả các lô thử nghiệm đều hoạt động bình thƣờng, tình trạng chung của chuột không có gì thay đổi đặc biệt (không có bất cứ một biểu hiện độc tính nào) và không có chuột nào chết trong suốt thời gian theo dõi. Do đó, không thể xác định đƣợc liều LD50.
Vậy BSP không thể hiện độc tính cấp đƣờng uống với liều tối đa có thể bơm qua đầu kim để cho chuột uống. Điều này cho phép chúng ta nhận định rằng bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm sử dụng trong thử nghiệm có độ an toàn khá cao trên súc vật thử nghiệm, đồng thời xác định đƣợc Dmax = 8,9 g/kg (liều tối đa có thể cho uống mà không có thú vật thử nghiệm nào chết).
3.3. Tác dụng hạ cholesterol của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm
3.3.1. Thử nghiệm tác dụng hạ lipid máu của bột sấy phun trên mô hình tăng lipid máu bằng tyloxapol (triton WR-1339) lipid máu bằng tyloxapol (triton WR-1339)
Bảng 3.6. Kết quả định lƣợng cholesterol toàn phần, triglycerid máu, HDL-C và LDL-C của chuột thử nghiệm (mmol/l)
Lô chuột Cholesterol TP Triglycerid HDL-C LDL-C
Chứng 2,52 ± 0,40 1,43 ± 0,28 1,37 ± 0,15 0,13 ± 0,03 Nƣớc cất + Tyloxapol (400mg) 3,09 * ± 0,37 2,26** ± 0,77 1,30 ± 0,28 0,31*** ± 0,09 Fenofibrat (200mg) + Tyloxapol 3,07 ± 0,53 1,16 ## ± 0,19 1,56 ± 0,32 0,18## ± 0,05 BSP1 (0,45g) + Tyloxapol 2,87 ± 0,40 1,71 ± 0,67 1,29 ± 0,26 0,19 # ± 0,1 BSP2 (0,9g) + Tyloxapol 3,11 * ± 0,38 1,27#± 0,39 1,51 ± 0,11 0,29*** ± 0,08
* : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05) ** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,01) *** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,001)
# : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm tyloxapol (p < 0,05) ## : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm tyloxapol (p < 0,01)
43
Nhận xét kết quả
Nhóm gây tăng lipid máu bằng tyloxapol có giá trị cholesterol toàn phần, triglycerid và LDL-C đều tăng có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng. Giá trị HDL-C không có sự khác biệt giữa các nhóm thử nghiệm. Cholesterol máu tăng cao chứng tỏ mô hình gây tăng lipid máu bằng tyloxapol (triton WR-1339), trong điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi xây dựng, đã ảnh hƣởng lên quá trình chuyển hóa lipid, gây tăng lipid máu ở chuột thử nghiệm.
Ở nhóm điều trị bằng fenofibrat, giá trị cholesterol toàn phần, triglycerid và LDL-C đã về giá trị bình thƣờng, khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng sau 1 tuần uống fenofibrat dự phòng. Giá trị triglycerid máu và LDL-C giảm so với nhóm tiêm tyloxapol, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Việc giảm các giá trị cholesterol sau khi uống fenofibrat chứng tỏ thuốc đối chứng sử dụng trong nghiên cứu đã có tác dụng điều trị đối với chuột thử nghiệm gây tăng lipid máu bằng tyloxapol.
Ở nhóm thử 1 uống BSP liều 1/20 LDmax = 0,45 g/kg và nhóm thử 2 uống BSP liều 1/10 LDmax = 0,9 g/kg, giá trị cholesterol toàn phần của nhóm thử 1 khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng trong khi giá trị này của nhóm 2 tăng cao hơn so với nhóm chứng, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Giá trị triglycerid máu của cả 2 nhóm đều giảm tới mức bình thƣờng nhƣng nhóm thử 2 giảm thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm tyloxapol (p < 0,05). Giá trị LDL-C của nhóm 1 giảm tới mức bình thƣờng và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm tyloxapol (p < 0,05) trong khi giá trị LDL-C của nhóm thử 2 vẫn tăng cao hơn so với nhóm chứng và tƣơng đƣơng với nhóm tiêm tyloxapol, khác biệt có ý nghĩa thống kê với nhóm chứng (p < 0,001). Việc giảm các giá trị cholesterol ở 2 nhóm thử với mức độ khác nhau chứng tỏ BSP đã có tác dụng điều trị đối với chuột thử nghiệm gây tăng lipid máu bằng tyloxapol. Tuy nhiên, hiệu lực và tác dụng ƣu tiên trên thông số lipid máu nào còn phụ thuộc vào liều sử dụng.
44
3.3.2. Thử nghiệm tác dụng hạ lipid máu của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm trên mô hình uống cholesterol trên mô hình uống cholesterol
Bảng 3.7. Kết quả định lƣợng cholesterol toàn phần, triglycerid máu, HDL-C và LDL-C của chuột thử nghiệm (mmol/l)
Lô chuột Cholesterol TP Triglycerid HDL-C LDL-C
Chứng 2,21 ± 0,43 1,82 ± 0,66 1,35 ± 0,27 0,16 ± 0,02 Nƣớc cất + Cholesterol (25mg) 2,93**± 0,31 1,31 ± 0,19 1,47 ± 0,29 0,32***± 0,04 Atorvastatin (10mg) +Cholesterol (25mg) 2,64 ± 0,50 1,43 ± 0,71 1,58 ± 0,54 0,27* ± 0,10 BSP1 (0,45g) +Cholesterol (25mg) 2,40## ± 0,33 2,04 ± 0,22 1,50 ± 0,27 0,22*##± 0,07 BSP2 (0,9g) +Cholesterol (25mg) 2,63 ± 0,46 1,86 ± 0,56 1,43 ± 0,28 0,23**## ± 0,04
* : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05) ** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,01) *** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,001)
## : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm uống cholesterol (p < 0,01)
Nhận xét kết quả
Nhóm gây tăng lipid máu bằng cholesterol có giá trị cholesterol toàn phần và LDL- C tăng có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng. Nhƣ vậy, 6 tuần uống cholesterol 25 mg/kg đã ảnh hƣởng lên quá trình chuyển hóa lipid, gây tăng lipid máu ở chuột thử nghiệm.
Ở nhóm điều trị bằng atorvastatin, tuy giá trị cholesterol toàn phần đã giảm và giá trị LDL-C cũng giảm nhƣng vẫn cao hơn nhóm chứng, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p
45
< 0,05). Nhƣ vậy, cần đánh giá lại liều atorvastin đã sử dụng và tiến hành khảo sát thêm liều atorvastatin đối với những nghiên cứu kế tiếp.
Ở 2 nhóm thử sử dụng BSP điều trị dự phòng, nhóm thử 1 uống BSP liều 1/20 LDmax = 0,45 g/kg và nhóm thử 2 uống BSP liều 1/10 LDmax = 0,9 g/kg. Giá trị cholesterol toàn phần của cả 2 nhóm đều giảm tới gần giá trị bình thƣờng, trong đó nhóm 1 giảm thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm uống cholesterol (p < 0,01). Giá trị LDL-C của cả 2 nhóm uống BSP đều giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm uống cholesterol (p < 0,01). Tuy nhiên, nhóm uống BSP liều 1/20 LDmax = 0,45 g/kg vẫn còn cao hơn so với nhóm chứng, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) và nhóm uống BSP liều 1/10 LDmax = 0,9 g/kg cao hơn so với nhóm chứng, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Việc giảm các giá trị cholesterol ở 2 nhóm thử với mức độ khác nhau chứng tỏ BSP đã có tác dụng điều trị đối với chuột thử nghiệm gây tăng lipid máu bằng cholesterol đƣờng uống. Tuy nhiên, tác dụng này còn phụ thuộc vào liều sử dụng.
Bàn luận
Với mục tiêu chính của đề tài là đánh giá tác dụng hạ lipid máu của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm, chúng tôi đã tiến hành gây tăng lipid máu cho chuột thử nghiệm bằng 2 mô hình: Mô hình gây tăng lipid cấp tính bằng cách tiêm phúc mô tyloxapol (triton WR-1339) 400 mg/kg và mô hình gây tăng lipid mãn tính bằng cách dùng cholesterol đƣờng uống 25 mg/kg trong 6 tuần liên tiếp, tham khảo theo các mô hình của những nghiên cứu trƣớc. Kết quả cho thấy:
Trên mô hình gây tăng lipid máu bằng tyloxapol, liều 0,45 g/kg đã làm giảm đồng thời các giá trị cholesterol toàn phần (7%), triglycerid (32%) và LDL-C (63%). Trong khi đó, liều 0,9 g/kg chỉ làm giảm giá trị triglycerid ở chuột thử nghiệm (78%), không thể hiện tác dụng trên 2 thông số cholesterol toàn phần và triglycerid.
Trên mô hình gây tăng lipid máu bằng cholesterol đƣờng uống, liều 0,45 g/kg đã làm giảm đồng thời 2 giá trị là cholesterol toàn phần (22%) và LDL-C (45%), ảnh hƣởng trên giá trị LDL-C tƣơng đƣơng với thuốc đối chứng atorvastatin đã sử dụng. Liều 0,9 g/kg đã làm giảm cholesterol 11% và LDL-C (39%), tuy nhiên vẫn còn cao hơn nhóm chứng, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01).
46
So sánh với các nghiên cứu trƣớc, đài hoa Bụp giấm chiết bởi các dung môi khác nhau (nƣớc, dung môi không phân cực, ethanol 50%, ethanol 80%,…) đều cho tác dụng hạ lipid máu với những mức độ khác nhau và phụ thuộc vào liều, ở liều 400 mg/kg có tác dụng cao hơn liều 200 mg/kg.[28], [34]
3.4. Tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm
Bảng 3.8. Kết quả định lƣợng AST, ALT, MDA, GSH của chuột thử nghiệm Lô chuột
AST (U/L) ALT (U/L)
MDA (nM/g protein) GSH (nM/g protein) Nƣớc cất 101,8 ± 21,77 50,0 ± 11,46 103,82 ± 18,25 11091,91 ± 1710 Gây độc 191,4 ± 44,60*** 88,6 ± 19,55*** 157,88 ± 43,30* 11887,89 ± 1598 Silymarin 50 mg/kg 144,6 ± 40,65*# 73,1 ± 17,26** 89,32 ± 16,40## 10960,73 ± 2168 BSP1 0,45g/kg 139,8 ± 27,57**## 66,8 ± 15,46*# 110,90 ± 18,74## 9200,36 ± 623 BSP2 0,9g/kg 166,4 ± 33,46*** 82,1 ± 20,98** 117,14 ± 40,96 10118,66 ± 2643
* : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05) ** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,01) *** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,001) # : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm gây độc (p < 0,05) ## : Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm gây độc (p < 0,01)
47
Bảng 3.9. Kết quả vi phẫu gan của các nhóm thử nghiệm (mức độ tăng của các nhóm so với nhóm chứng uống nƣớc cất)
Tế bào gan thoái hóa mỡ
TB gan hoại tử Xâm nhập TB viêm đơn nhân Xâm nhập TB viêm đa nhân Viêm khoảng cửa Tăng sinh tái tạo TB gan Độc
Tăng 2% loại không bào nhỏ rải rác trong tiểu thùy, 2% loại không bào lớn trong tiểu thùy và quanh TMTT tiểu thùy
+ 0 + + 0
Sily marin
Tăng 0,4 % loại không bào nhỏ rải rác trong tiểu thùy
0 0 0 0 0
BG1
Tăng 1,5 % loại không bào nhỏ rải rác trong tiểu thùy
0 0 0 0 0
BG2
Tăng 5 % loại không bào nhỏ rải rác trong tiểu thùy
+ 0 + 0 0
Kết quả được đọc bởi Khoa Giải Phẫu Bệnh – Bệnh viện Chợ Rẫy TP.Hồ Chí Minh
Nhận xét kết quả:
Ở lô gây độc bằng ethanol, các chỉ số AST, ALT tăng có ý nghĩa thống kê (p < 0,001), MDA tăng (p < 0,05) so với nhóm chứng, đồng thời kết quả sinh thiết gan cho thấy có sự tổn thƣơng gan, hoại tử ở mức độ nhẹ và có biểu hiện của phản ứng viêm trong tế bào. Giá trị GSH không có sự khác biệt giữa các nhóm thử nghiệm. Nhóm uống silymarin có giá trị AST giảm (p < 0,05), ALT, MDA giảm (p < 0,01) và mức độ viêm tại tế bào gan cũng giảm so với nhóm gây độc. Nhóm uống BSP với liều 0,45 g/kg có giá trị AST giảm (p < 0,01), ALT giảm (p < 0,05) và MDA giảm (p < 0,01) so với nhóm gây độc. Nhóm uống BSP liều 0,9 g/kg có biểu hiện giảm AST, ALT và MDA so với nhóm gây độc nhƣng chƣa đạt ý nghĩa thống kê. Sinh thiết gan cho thấy mức độ giảm tổn thƣơng gan ở nhóm uống BSP 0,45 g/kg.
48
Bàn luận
Với mục tiêu chính của đề tài là đánh giá tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm, chúng tôi đã tiến hành gây độc cấp tính cho chuột thử nghiệm bằng mô hình uống ethanol 40%, 5 g x 3 lần cách nhau 12 giờ, tham khảo theo các mô hình của những nghiên cứu trƣớc. Kết quả cho thấy:
Mô hình đã gây tăng men gan AST, ALT và chỉ số MDA ở chuột thử nghiệm có ý nghĩa thống kê p < 0,001 với chỉ số AST và ALT, p < 0,05 với chỉ số MDA.. Ngoài ra, kết quả nhuộm vi phẫu gan cũng cho thấy sự tổn thƣơng gan cấp tính ở chuột thử nghiệm lô gây độc khi có dấu hiệu tế bào gan hoại tử mức độ nhẹ, có