NỘI DUN GỜ NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Phương pháp xét nghiệm
Chúng tôi sử dụng các kỹ thuật xét nghiệm, phân lập và giám ựịnh vi sinh vật theo tiêu chuẩn quy ựịnh của Việt Nam, ựồng thời tham khảo của Newzeland, 1991, FAO 1992 và của Viện Y học Lao ựộng và Vệ sinh Môi trường Bộ Y tế, Hà Nội 1993.
* Phương pháp kiểm tra vi sinh vật có trong nguồn nước sử dụng cho giết mổ.
Sử dụng phương pháp lấy mẫu và phân tắch vi khuẩn nước uống (theo tiêu chuẩn Việt Nam 2680 Ờ 1978 Nà Nội 1978).
* Phương pháp xác ựịnh vi khuẩn hiếu khắ
* Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu: dùng chai nút mài 500ml ựã ựược hấp, sấy tiệt trùng. Lấy mẫu nước trong bể chứa hay ựầu vòi nước sử dụng. Trong thao
tác lấy mẫu ựảm bảo vô trùng sau ựó chuyển về phòng phân tắch.
* Tiến hành phân tắch: Sử dụng phương pháp rót thạch, ựể xác ựịnh vi
khuẩn. Mẫu nước ựược pha loãng ở các ựậm ựộ khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3,..
mỗi ựậm ựộ cấy vào hai ựĩa petri, rót vào mỗi ựĩa 12 ựến 15ml môi trường
thạch 460C, trộn ựều thạch với dung dịch pha loãng bằng cách lắc ựi lắc lại 2
ựến 3 lần. để ựĩa thạch ựộng tự nhiên và úp lại, bồi dưỡng trong tủ ấm 370C
trong 24h. đọc kết quả và tắnh toán theo công thức:
A + 10B + 100C + 1000D N (VSV/1ml) =
N N: Số lượng vi sinh vật trong 1ml nước.
A: Số khuẩn lạc trong 1ml ở trạng thái ban ựầu (không pha)
B: Số khuẩn lạc trong 1ml ở ựộ pha loãng 1/10 hay 10-1.
C: Số khuẩn lạc trong 1ml nước ở ựộ pha loãng 1/100 hay 10-2.
D: Số khuẩn lạc trong 1ml nước ở ựộ pha loãng 1/100 hay 10-3.
N: Số ựậm ựộ pha loãng.
* Phương pháp xác ựịnh vi khuẩn E.coli
Mẫu nước kiểm tra pha loãng ở các ựậm ựộ 10-1,10-2,10-3,...Mỗi mẫu
phải nuôi cấy ắt nhắt ở 3 ựậm ựộ liên tiếp.
* Bước 1:
- Cách tiến hành: Nước không pha (nước nguyên) ựược cấy vào 3 ống
môi trường CLP 1,5% (canh thang lactose), ở ựậm 10-1,10-2,10-3,.. Mỗi ựậm
ựộ nuôi cấy trong 3 ống canh thang CLP 0,5%/
- Mỗi ống canh thang CLP 1,5% cho 1ml nước nguyên.
- Mỗi ống canh thang CLP 0,5% cho 1ml nước pha loãng 10-1,10-2,10-3,
để tủ ấm 420C trong 24 Ờ 48h, ựọc kết quả.
đọc các ống dương tắnh: Môi trường chuyển màu từ tắm sang màu vàng và có sinh hơi (làm nổi ống Durham). Tra bảng MPN (Most prohable
Number) tắnh kết quả.
* Bước 2:
Từ những ống dương tắnh ở trên, dùng que cấy vô trùng lấy một vòng canh trùng ria cấy trên thạch Endo hoặc môi trường MacConkey.
để tủ ấm 370C trong 24h, ựọc kết quả.
- Trên môi trường MacConkey: Khuẩn lạc E.coli có dạng S bờ ựều, bóng.
Từ những khuẩn lạc nghi E.coli, dùng que cấy vô trùng cấy vào các
môi trường sau:
Ure-Indol: để kiểm tra tắnh chất sinh ánh kim, Indol (+). Clark Ờ Lubs ựể kiểm tra:
Phản ứng ựỏ Methyl: MR+.
Phản ứng Voges Ờ proskaucr: V(-) Simmon Ờ Citrat: C(-)
để tủ ấm 370C trong 24h. đọc kết quả.
E.coli cho phép kiểm nghiệm IMVIC (+,+,-,-) trang bảng MPN ựể xác ựịnh
tổng số E.coli trong 1000ml nước (Coliindex) và tắnh số ml nước có 1 E.coli.
* Phương pháp xác ựịnh mức ựộ nhiễm vi khuẩn ựối với thịt
Áp dụng phương pháp nghiên cứu dịch tế học của Dương đình Thiện,(1998) về tắnh nguy cơ tương ựối RR (Relative Risk). Chúng tôi tiến hành tắnh mức ựộ nhiễm một số vi khuẩn gây ool nhiễm như sau:
Hậu quả Mẫu 1 Mẫu 2 Cộng Vùng 1 a b a + b Phơi nhiễm Vùng 2 c d c + d Cộng a + c b + d a + b + c + d a/(a+b) RR = c/(c+d)
- RR>1: là mối quan hệ giữa bện và phơi nhiễm, RR càng lớn thì sự kết hợp giữa bệnh và phơi nhiễm càng chặt.
- RR = 1: Bệnh và phơi nhiễm không liên quan - RR<1: Nói lên sự liên quan âm tắnh (cáo bảo vệ). 1. đồng nhất mẫu và trước khi làm giàu:
--- 2.25ml BPW 2% 25g thực phẩm 2. Làm giàu: 370C/16-20h 1ml 10ml Selenit 3. Phân lập trên ựĩa.
42 Ờ 430C/48h
MacConkey 370C/24h Brilliant green 370C/24h
4. Kiểm tra tắnh chất sinh hoá:
Thạch KIA Mannit Ure LDC OCD ADH ONPG thường di ựộng Indol
5. Kiểm tra ngưng kết với kháng huyết thanh:
370C/24h
Sơ ựồ 2.1: Xác ựịnh vi khuẩn Salmonella
1. Lấy mẫu pha loãng mẫu: 1ml 1ml 1ml 90ml BPW 90ml BPW 90ml BPW 90ml BPW 10g(10lm) thực phẩm 10-1 10-2 10-3 10-4 2. Bước 1: 10ml 10ml 10ml 1ml 1ml 1ml
Ct.lactose ựặc Ct.lactose loãng Ct.lactose loãng Ct.lactose loãng Ct.lactose loãng
3. Bước 2:
44-45,50C/24-48h
Endo: đọc tắnh chất sinh ánh kim ựể xác ựịnh tổng số faecal coliforms DC: đọc khuẩn lạc nghi ngờ là Ecoli. Rồi tiến hành làm.
để xác ựịnh tổng số E.coli (dựa vào bảng chỉ số MPN)
TestIMVIC
Ct.lactose mật bò ựặc Ct.lactose mật bò ựặc Ct.lactose mật bò ựặc
Sơ ựồ 2.2: Xác ựịnh tổng số vi khuẩn E.coli (Nguồn ISO 5552: 1997E)
370C/ 24-48h 24-48h
Phương pháp xác ựịnh vi khuẩn Salmonella
Kỹ thuật phát hiện Salmonella ựược dựa trên phương pháp của FAO
(1992), New Zealand (1991) và ISO 6579: 1993
* Chuẩn bị mẫu, ựồng nhất mẫu
Các mẫu thịt ựược xay hoặc cắt nhỏ, rồi giã trong cối sứ vô trùng. Sau ựó cân 25g mẫu cho vào bình có chứa 225ml nước ựệm pepton (BPW) 2%,
lắc ựều trong 2 phút, ựể tủ ấm 370C trong 16 Ờ 20 giờ.
* Tăng sinh
Dùng pipet vô trùng hút 1ml BPW ựã ủ ấm trên, cho vào một ống
nghiệm có chứa 10ml canh thang Selenit, ựể tủ ấm 42-430C trong 48 giờ.
* Phân lập trên các ựĩa thạch chọn lọc:
Dùng que cấy vô trùng, cấy ria canh trùng từ ống tăng sinh lên 2 ựĩa
thạch Brilliant green và MacConkey, rồi ựể tủ ấm 370C trong 24 giờ, yêu cầu
cấy thưa ựể tạo các khuẩn lạc riêng rẽ.
* Chọn khuẩn lạc và kiểm tra trên môi trường KIA
Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, các khuẩn lạc phát triển trên các môi
trường chọn lọc ựã ựược kiểm tra. Lấy ắt nhất 3 khuẩn lạc nghi ngờ là vi
khuẩn Salmonella cho một mẫu, cấy chuyển vào môi trường kiểm tra KIA
theo phương pháp cấy trắch sâu. Môi trường ựược nuôi cấy ở 370C, 24 giờ.
Kiểm tra những ống KIA có các tắnh chất như sau:
K/AG có sinh hơi, sinh H2S hoặc không sinh H2S.
K/A không gas, có sinh H2S ựược giữ lại ựể kiểm tra tiếp.
Kiểm tra Urese, Indol và Lysin decarboxylase
Những mẫu có phản ứng ựặc trưng của vi khuẩn Salmonella trên trường
KIA ựược cấy kiểm tra vào Ure, Indol và Lysin Decarboxylase. Trước khi tiến hành làm phản ứng thuyết thanh học với các kháng huyết thanh
Salmonella chuẩn, một số ựặc tắnh sinh vật hóa học cũng ựã ựược kiểm tra với ựường Glucose, Lactose, Mannitol, Malonate, Dulcitol, kiểm tra di ựộngẦ
* Phương pháp thử phản ứng ngưng kết trên phiến kắnh
Dựa vào sơ ựồ của Kauffmann ỜWhite (WHO, 1990) giám ựịnh nhóm huyết thanh O ựa giá theo hướng dẫn của hãng Remel ựược sản xuất bởi công ty Murex Biotech Ltd, England.
Theo sơ ựồ này, vi khuẩn Salmonella ựược chia thành các nhóm O, A Ờ
S. Sau khi ựịnh dạng bằng kháng huyết thanh O ựa giá, tiến hành ựịnh danh bằng kháng huyết thanh H. Kỹ thuật ngưng kết trên phiến kắnh, cách tiến hành: Trên phiến kắnh sạch, lấy bút chì mỡ vạch thành các bờ ựể ngăn chia phiến kắnh thành nhiều ô nhỏ, khoảng 4-5mm. Dùng pipet hoặc ống hút Pasteur, nhỏ chồng lên nhau 1 giọt huyễn vi khuẩn cần kiểm tra và 1 giọt
kháng huyết thanh Salmonella, sau ựó dùng ựầu pipet trộn vào nhau tạo thành
một khối ựục ựều. đọc kết quả sau 30 giây ựến 1 phút.
Phản ứng dương tắnh: Hình thành ngưng kết nhỏ li ti có thể thấy bằng mắt thường, huyễn dịch trở nên trong.
Phản ứng âm tắnh: Không có hạt ngưng kết, huyễn dịch ựục ựều.
Phương pháp xác ựịnh tổng số Staphylococcus aureus trong thịt và sản phẩm của thịt.
* Môi trường và thuốc thử
- Nước ựệm pepton - Baird parker
- Canh thang Brain Heart Infusion (BHI) - Huyết tương thỏ.
* Xử lý mẫu
Cân 25g mẫu cho vào bình hóa lỏng vô trùng, thêm 225ml dung dịch pha loãng pepton, trộn ựền trong 1 Ờ 2 phút ở tốc ựộ 10.000 Ờ 12.000 vòng /
phút. Sử dụng dung dịch pha loãng liên tục từ 10-6 Ờ 10-7 bằng cách di chuyển
* Nuôi cấy mẫu
- Nuôi cấy phân lập
Chuyển vô trùng 1ml của mỗi nồng ựộ pha loãng vào giữa từng ựĩa thạch Baird parker ựã ựược hong khô. Mỗi nồng ựộ cấy 2 ựĩa. Láng sao cho
dung dịch ựều trên mặt thạch, lật ngược ựĩa ựể trong tủ ấm 370C ổ10C trong
vòng 24 Ờ 48h.
Sau ựó lựa chọn các ựĩa có từ 30 Ờ 300 khuẩn lạc màu ựen tròn, lồi, bờ ựều, bóng có vòng trong suốt ở xung quanh, sử dụng máy ựếm khuẩn lạc ựể ựếm các khuẩn lạc nghi ngờ.
- Khẳng ựịnh
Khẳng ựịnh bằng cách thực hiện các phép thử kiểm tra ựặc tắnh làm
ựông huyết tương của vi khuẩn Staphylococcus aureus.
Lấy khuẩn lạc nghi ngờ là Staphylococcus aureus tăng sinh trong môi
trường canh thang BHI, ựể tủ ấm 35 Ờ 370C trong vòng 20 Ờ 24h.
Lấy canh trùng cho vào huyết tương thỏ theo tỷ lệ 1:4 (0,1ml canh