1 Các phương pháp xác định hoạt độenzyme
1.4Xác định hàm lượng phytat theo phương pháp Wade Nguyên tắc
Nguyên tắc
Nguyên tắc: Sử dụng dung dịch HCl 2,4% để chiết axit phytic ra khỏi mẫu, sau đó bổ sung dung dịch Wade (0,03% FeCl3 và 0,3% axit sulfosalisylic) để phản ứng với axit phytic, lượng dung dịch Wade không tác dụng với axit phytic được xác định bằng cách so màu ở bước sóng 500nm, từ đó tính được hàm lượng axit phytic đã tác dụng với dung dịch Wade.
Dụng cụ và hóa chất a. Dụng cụ
Máy so màu UV- vis
Dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm
b. Hóa chất
HCl 2,4%
Thuốc thử Wade Axit phytic NaOH 1N
Xây dựng đường chuẩn
Dựng đường chuẩn: lấy 0,5g phytat hòa tan trong 10ml HCl 2,4% nồng độ 50000µg/ml lắc nhẹ để hòa tan hoàn toàn phytate. Pha loãng dung dịch theo các nồng độ 0, 100, 200, 300, 400, 500 µg/ml. Lấy 2ml dịch ở các nồng độ trên trung hòa bằng NaOH 1N về pH 4,0÷ 4,5( giấy quỳ màu cam nhạt). Sau đó, lấy 3ml dung
500nm.
Nồng độ phytat
(µg/ml) 0 100 200 300 400 500
OD500 0,53 0,41 0,32 0,21 0,10 0,06
V NaOH (1N) 1,08 1,1 1,08 1,1 1,08 1,1
1.5Xác định hoạt độ phytase: phương pháp đo đường kính vòng phân giải Nguyên tắc
Cho phytase tác dụng lên cơ chất phytat trong môi trường thạch, cơ chất bị phân giải, độ đục của môi trường bị giảm, môi trường trở nên trong suốt. Độ lớn của vòng phân giải phản ánh mức độ hoạt động của phytase.
Cách tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị môi trường kiểm tra phytase
- Phytat: 0,5g
- Nước cất: 90ml
- Agar: 1,5g
- Dung dịch CaCl2: 10ml
Phytat được hòa tan với nước, lọc lấy dịch lọc cộng với nước đủ 90ml cho thêm agar đem đun cho tan. Sau khi đun bổ sung 10ml CaCl2 5% rồi đổ đĩa.100ml đổ 4 đĩa.
Bước 2: Đục lỗ (giếng) trên môi trường.
Một mẫu kiểm tra hoạt độ enzym cần làm 2 giếng.
Bước 3: Nhỏ dung dịch cần kiểm tra hoạt độ enzym vào ủ 12- 24 giờ Bước 4: Đo đường kính vòng trong