1 Các phương pháp xác định hoạt độenzyme
1.1 Xác định hoạt độenzyme phytase theo phương pháp Fiske và Subbarow[15]
Subbarow[15]
Nguyên tắc:
Khi khử phosphate tác dụng với amonium molybdat sẽ tạo ra phosphomolybdat có màu vàng. Khi khử phosphomolybdat sẽ chuyển về molybdat màu xanh. Độ đậm nhạt phù thuộc vào lượng phosphor có trong mẫu.
2(MoO2.4MoO3) + H3PO4 + 4H2O (MoO2.4MoO3)2.3H3PO4. 4H2O
Các chất khử thường được dùng là SnCl2, hydrazine, acid ascorbic, FeSO4, quinon, oxalate, sulfide. Các chất khử có thể được sử dụng đơn độc hoặc riêng lẻ với nhau.
Hóa chất:
Dung dịch cơ chất: sodium phytate 0,2% (w/v) trong đệm sodium acetate 0,1M pH=5 cân 1g sodium phytate pha trong 500ml nước cất.Dùng acid acetic đậm đặc chỉnh về pH=5. Bảo quản ở nhiệt độ lạnh.
Dung dịch phosphor mẫu 0,01M: cân 0,136g K2HPO4 hòa với nước cất thành 100ml
Dung dịch phosphor 500nmol/ml: hút 5ml phosphor 0,01M pha thành 100ml
Dung dịch ammonium molybdat 1,5% (w/v) trong H2SO4 5,5% (ký hiệu là dung dịch A)
Hút 28ml dung dịch H2SO4 đậm đặc (98%) pha với nước cất thành 500ml, được dung dịch H2SO4 5,5%. Cân 7,5g [(NH4)6Mo7O24.4H2O] hòa tan trong 500ml H2SO4 5,5%
Dung dịch FeSO4 5%: cân 5g FeSO4 hòa với nước cất để lạnh thành 500ml (ký hiệu là dung dịch B). Dung dịch sử dụng liền, không bảo quản. Dung dịch phải có màu trong suốt, không có màu hoặc màu vàng nhạt. Nếu có màu vàng đậm thì phải pha lại.
Dung dịch thuốc thử phosphate : pha hỗn hợp dung dịch A:B=4:1. Dung
dịch phải không màu, nếu có kết tủa xanh thì phải pha lại. Dung dịch thuốc thử xếu sử dụng chưa hết thì phải bảo quản lạnh tối đa 4 ngày.
Dung dịch TCA (acid tricloacetic) 5%: cân 25g TCA hòa với nước cất thành 500ml
Lấy ống nghiệm, tiến hành pha phosphor với nồng độ như sau: Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Dung dịch phosphor 500(nmol/ml ) 0 1 2 3 4 5 Nước cất 5 4 3 2 1 0 Nồng độ phosphor (nmol/ml) 0 100 200 300 400 500 Thuốc thử phosphate (ml) 5 5 5 5 5 5
Lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng, đem đo mật độ quang ở bước sóng 700nm. Dựng đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (ΔOD) theo nồng độ phosphor (nmol/ml).
Chuẩn bị mẫu có enzyme
Cân m(g) chế phẩm enzyme nghiền và hòa tan trong V(ml) dung dịch đệm sodium acetate với pH phù hợp sẽ được dịch enzyme thô. Đối với dịch lỏng, lấy trực tiếp để phản ứng. Xác định hoạt độ enzyme trong phản ứng này. Bố trí như sau:
Ống nghiệm Mẫu thử Mẫu chứng
Dung dịch cơ chất phytate (ml)
2 2
Dung dịch TCA 5% (ml) 0 2,5
Dung dịch enzyme (ml) 2,5 0
Dung dịch enzyme (ml) 0 0,5
Thuốc thử phosphate (ml) 2,5 5
Lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, đo mật độ quang ở bước sóng 700nm
Cách tính
Đơn vị hoạt độ của enzyme phytase được xác định như sau: một đơn vị hoạt độ tương ứng với 1μg phosphor trong thời gian thủy phân cơ chất sodium phytate 1h ở nhiệt độ 50oC.
Đơn vị hoạt độ/g (hoặc ml) chế phẩm =
x: số nmol phosphor suy ra từ đường chuẩn (nmol/l) v: thể tích dung dịch phản ứng (5ml)
d: độ pha loãng enzyme
0,5: thể tích enzyme cho vào phản ứng (ml) m: khối lượng chế phẩm enzyme phân tích (g)