Bảng 4. 2: Kết quả lập đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men
Mẫu Pha loãng ∆OD Tế bào/ml log(tế bào/ml)
0 0 0.266 1.02E+07 7.01
4 0 0.753 7.05E+07 7.85
SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 39
24 10 0.402 1.75E+08 8.24
Mẫu Pha loãng ∆OD Tế bào/ml log(tế bào/ml)
28 10 0.424 1.91E+08 8.28 32 10 0.428 1.94E+08 8.29 48 10 0.422 1.89E+08 8.28 52 10 0.415 1.84E+08 8.26 56 10 0.410 1.80E+08 8.26 72 10 0.410 1.80E+08 8.26 76 10 0.400 1.73E+08 8.24 80 10 0.396 1.71E+08 8.23 96 10 0.372 1.55E+08 8.19 100 10 0.382 1.61E+08 8.21 104 10 0.394 1.69E+08 8.23
Đồ thị 4. 2: Đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men
SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 40 4.1.3. Đƣờng chuẩn đƣờng tổng Bảng 4. 3: Kết quả lập đƣờng chuẩn đƣờng tổng Nồng độ (µg/ml) ∆OD 0 0.000 10 0.111 20 0.204 30 0.327 40 0.425 50 0.532 Lƣợng sucrose (µg/ml) = 93.91*∆OD-0.011 Đồ thị 4. 3: Đƣờng chuẩn đƣờng tổng
SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 41
4.2. Kết quả cố định
4.2.1. Ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng cố định
Bảng 4. 4: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng cố định
Đồ thị 4. 4: Ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng cố định
Dựa vào đồ thị ta thấy, thời gian có ảnh hƣởng đến khả năng cố định của nấm men. Và ảnh hƣởng này gần nhƣ là tuyến tính trong thời gian đầu. Lƣợng nấm men cố định đƣợc trên giá thể tăng nếu thời gian cố định tăng. Điều này là hoàn toàn hợp lý.
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng cố định
Thời gian (giờ) cfu/đĩa cfu/g
8 30 1.49 .107
16 37 1.83 .107
20 41 2.03 .107
SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 42
Khi tăng thời gian cố định, không những giúp ổn định liên kết của nấm men và bề mặt chất mang mà còn là điều kiện để nấm men tăng sinh trên chất mang. Nấm men lúc này không những sử dụng dinh dƣỡng trong môi trƣờng để tăng sinh mà còn sử dụng lƣợng đƣờng sẵn có trên chất mang. Do đó, lƣợng tế bào nấm men tăng theo thời gian và nấm men càng lúc càng tiến sâu vào trong cấu trúc của giá thể là mía. Điều này giúp lƣợng tế bào nấm men trong giá thể tăng lên và ổn định hơn theo thời gian, làm tăng khả năng lên men và tái sử dụng chế phẩm so với những cơ chất không chứa chất dinh dƣỡng khác nhƣ bã mía, gỗ, thủy tinh hay sứ.
Ở giai đoạn đầu (từ 8 đến 20 giờ), sự tăng lƣợng tế bào trên chất mang tuyến
tính với thời gian, lần lƣợt là 1.49, 1.83 và 2.03x107 cfu/g cho 8, 16 và 20 giờ cố
định. Nhƣng ở giai đoạn sau sự gia tăng không còn tuyến tính nữa (2.13x107 cfu/g ở
24 giờ). Điều này có thể là do trong thời gian đầu, lƣợng tế bào trên bề mặt tăng sinh và gắn hết vào những vị trí trên bề mặt chất mang. Do đó, theo thời gian ta thấy có sự tăng tuyến tính nhƣ trên. Nhƣng càng về sau, lƣợng tế bào chủ yếu đi sâu vào trong chất mang, lƣợng tế bào trên bề mặt không tăng lên nhiều do diện tích bề mặt đã bị chiếm hết bởi tế bào trƣớc đó. Điều này làm ổn định và tăng hiệu quả cho chất mang. Tuy nhiên, thời gian cố định không đƣợc quá lâu. Bởi thời gian cố định quá lâu sẽ làm tăng chi phí cho quá trình. Mặc khác, nếu thời gian cố định quá lâu thì môi trƣờng hết dinh dƣỡng có thể không cung cấp đủ cho sự phát triển của tế bào, và những chất tạo thành trong quá trình trao đổi chất trƣớc đó có thể gây ức chế cho sự phát triển của tế bào.
Nói tóm lại, thời gian có ảnh hƣởng lớn đến hiệu quả cố định tế bào. Không phải thời gian cố định càng lâu càng tốt mà nó phải dung hòa giữa khả năng cố định, sức sống của tế bào cũng nhƣ là hiệu quả kinh tế của quá trình. Trong quá trình cố định nấm men trên mía, 24 giờ là thời gian cố định tốt nhất có đƣợc. 24 giờ cũng là thời gian đƣợc Anuj K. Chandel và cộng sự áp dụng để cố định nấm men trên cây mía hoang dại. Jianliang và cộng sự cũng cố định nấm men trong 24 trên bã lúa miến để sản xuất cồn [5, 14].
SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 43
4.2.2. Ảnh hƣởng của chế độ lắc đến khả năng cố định
Bảng 4. 5: Kết quả ảnh hƣởng của chế độ lắc đến khả năng cố định
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của chế độ lắc đến khả năng cố định Tốc độ (rpm) cfu/đĩa cfu/g 80 15 0.75 .107 100 42 2.10 .107 120 39 1.95 .107 140 31 1.55 .107 160 17 0.85 .107 Đồ thị 4. 5: Ảnh hƣởng của chế độ lắc đến khả năng cố định
Trong quá trình cố định, việc đảo trộn nấm men rất quan trọng, đặc biệt khi thời gian cố định lớn. Đảo trộn giúp nấm men không bị lắng, làm tăng khả năng tiếp xúc của nấm men và giá thể đồng thời cũng làm tăng khả năng tăng sinh của nấm men. Tuy nhiên, nếu sự đảo trộn quá mạnh thì lại có tác dụng ngƣợc lại. Khi đó, mối liên kết chƣa bền vững của nấm men và giá thể dễ bị đứt do tác động mạnh của va chạm,
SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 44
mặc khác sự đảo trộn quá mạnh có thể phá vỡ cấu trúc cũng nhƣ hình dạng của giá thể. Việc đảo trộn quá mạnh cũng làm tăng tỷ lệ rửa trôi tế bào cố định vào trong dịch huyền phù cố định.
Khi khảo sát cố định nấm men trên giá thể là mía, chế độ lắc 100 vòng/phút là
tốt nhất (đạt 2.1x107 cfu/g). Ở chế độ này, lƣợng tế bào cố định đƣợc trên mía là lớn
nhất do sự đảo trộn vừa phải làm gia tăng khả năng tiếp xúc của nấm men và mía, mà không làm phá vỡ cấu trúc giá thể cũng nhƣ không làm đứt liên kết tĩnh điện giữa nấm men và bề mặt giá thể. Bên cạnh đó, chế độ lắc 100 vòng/phút cũng không làm tăng tỷ lệ rửa trôi nấm men cố định đƣợc trên mía. Một chế độ lắc vừa phải cũng làm gia tăng khả năng đi sâu vào trong cấu trúc giá thể và tăng khả năng tăng sinh. Các chế độ lắc còn lại thì quá yếu hoặc quá mạnh. Với chế độ lắc 80 vòng/phút, lƣợng tế bào cố
định đƣợc là 0.75x107, mật độ này là quá thấp. Ở chế độ lắc này, tốc độ lắc không đủ
mạnh để đảo đều huyền phù nấm men và giá thể mía, lƣợng nấm men bị lắng một phần, do đó, lƣợng tế bào cố định đƣợc trên giá thể thấp. Còn ở các chế độ 120, 140 và
160 vòng/phút, lƣợng nấm men cố định đƣợc lần lƣợt là 1.95, 1.55, 0.85x107
cfu/g. Ta thấy tỉ lệ tế bào nấm men cố định đƣợc giảm dần, điều này là do tốc độ lắc tăng làm đứt liên kết của nấm men và giá thể, tăng tỷ lệ rửa trôi tế bào nấm men vào trong huyền phù.
Tóm lại, chế độ cố định tốt nhất khảo sát đƣợc là lắc ở 100 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Chế độ này đƣợc áp dụng để tạo ra chế phẩm cố định dùng trong các thí nghiệm lên men kế tiếp.
4.3. Kết quả khảo sát quá trình lên men nƣớc mía bằng nấm men cố định
4.3.1. Ảnh hƣởng đến thời gian lên men
Bảng 4. 6: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng lên men
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng lên men
Thời gian Đƣờng tổng
ban đầu Chuyển hóa Ethanol tạo thành
Hiệu suất lên men Sản lƣợng (ngày) mg/ml % %v/v g/100ml % % 3 156.72 94.16 10.92 8.62 58.38 54.97 4 96.35 11.56 9.12 62.85 58.19 5 94.94 11.00 8.68 57.90 54.97
SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 45
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng lên men
Thời gian Đƣờng tổng
ban đầu Chuyển hóa Ethanol tạo thành
Hiệu suất lên men Sản lƣợng (ngày) mg/ml % %v/v g/100ml % % 6 96.29 10.84 8.55 57.32 55.19 7 95.81 10.51 8.29 55.21 52.90 8 97.31 10.05 7.93 52.00 50.60
Đồ thị 4. 6: Ảnh hƣởng của thời gian lên men
Dựa vào đồ thị ta thấy, thời gian tốt nhất để lên men nƣớc mía ở 30oC, pH 4 và
độ Brix 20 là 4 ngày. Sau 4 ngày lên men bằng 10g chế phẩm cố định, lƣợng ethanol sinh ra là cao nhất, đạt 11.56%v/v tƣơng ứng với 91.2 g/l. Tăng thời gian lên men, lƣợng ethanol càng giảm và giảm khá đều, lần lƣợt là 11%, 10.84%, 10.51% và 10.05% tƣơng ứng với 5, 6, 7 và 8 ngày lên men. Việc giảm lƣợng ethanol khi kéo dài thời gian lên men do nấm men bị ức chế bởi ethanol trong dung dịch, đồng thời ethanol bị oxy hóa thành các hợp chất khác. Nếu thời gian lên men là 3 ngày thì lƣợng ethanol tạo thành thấp (10.92%v/v) và hiệu suất chuyển hóa cũng thấp (94.16%). Thời gian lên men quá ngắn thì nấm men chƣa tiêu thụ hết đƣờng trong dịch lên men, làm tăng thất thoát và hiệu suất chuyển hóa làm giảm hiệu quả kinh tế của quá trình. Do
SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 46
đó, thời gian lên men phải vừa đủ để nấm men tiêu thụ gần hết lƣợng đƣờng trong dung dịch không chỉ để tăng sinh mà để tạo ra sản phẩm chủ yếu là ethanol. Đó là mục đích chính của quá trình lên men.
Khi so sánh với nấm men tự do, thời gian lên men tốt nhất của nấm men tự do thƣờng là 7 ngày. Ta thấy, nấm men cố định đã cải thiện đáng kể về thời gian lên men, điều này giúp giảm rất nhiều trong chi phí quá trình và giảm đáng kể giá thành sản phẩm. Việc giảm đáng kể thời gian lên men khi lên men bằng nấm men cố định là do mật độ tế bào trong chế phẩm cố định cao hơn so với cùng một khối lƣợng nấm men tự do.
Trong trƣờng hợp lên men nƣớc mía bằng chế phẩm nấm men cố định trên mía này, ta còn giảm đƣợc thời gian thích nghi của nấm men với môi trƣờng mới vì có sự tƣơng đồng giữa môi trƣờng lên men và giá thể cố định. Đây cũng là một trong những lý do làm giảm thời gian lên men. Ta chọn 4 ngày là thời gian lên men để tiếp tục khảo sát các yếu tố khác ảnh hƣởng đến quá trình lên men bằng chế phẩm cố định.
4.3.2. Ảnh hƣởng của độ Brix
Bảng 4. 7: Kết quả ảnh hƣởng của độ Brix đến khả năng lên men
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của độ Brix đến khả năng lên men
Brix Đƣờng tổng
ban đầu Chuyển hóa Ethanol tạo thành
Hiệu suất lên
men Sản lƣợng % mg/ml % %v/v g/100ml % % 12 75.87 95.25 6.04 4.76 65.87 62.74 14 100.37 96.23 6.85 5.40 55.91 53.80 16 114.46 95.00 8.32 6.57 60.37 57.36 18 135.12 95.11 9.06 7.15 55.60 52.88 20 165.17 95.95 11.32 8.93 56.35 54.06 22 208.12 93.10 10.51 8.29 42.79 39.83
Nấm men tự do thƣờng lên men trong khoảng hàm lƣợng chất khô từ 15 – 18%. Khi khảo sát quá trình lên men của chế phẩm cố định ở các nồng độ chất khô khác nhau của dịch nƣớc mía ta thu đƣợc kết quả trình bày trong bảng 4.7 ở trên. Theo đó, trong khoảng nồng độ chất khô từ 12 – 20%, lƣợng ethanol tạo thành cũng tăng theo; nồng độ 20% là tốt nhất để lên men vì cho lƣợng ethanol cao nhất (11.32%). Lƣợng ethanol sinh ra khi sử dụng môi trƣờng nƣớc mía ở các độ Brix từ 12 – 18% thấp hơn
SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 47
hẳn so với độ Brix 20% mặc dù hiệu suất chuyển hóa là tƣơng đƣơng nhau (khoảng 95 – 96%). Điều này cho thấy mật độ tế bào trong chế phẩm cố định khá cao, nên lƣợng đƣờng trong dung dịch lên men khi độ Brix thấp là không đủ để tế bào tăng sinh và lên men. Mặc khác, tế bào khi đƣợc cố định trong giá thể thì hoạt tính enzyme tăng, nên khả năng hấp thụ và lên men đƣờng tăng so với tế bào tự do. Giá thể cố định cũng nhƣ là lớp bảo vệ, giúp tế bào chống chịu với áp suất thẩm thấu cao của môi trƣờng lên men có nồng độ chất khô cao. Mặc khác, dung dịch lên men có áp suất thẩm thấu cao cũng là một nhân tố giúp hạn chế tạp nhiễm hiệu quả.
Khi lên men dịch có độ Brix cao (22%), lƣợng ethanol tạo thành và hiệu suất lên men giảm mạnh (10.51 %v/v và 42.79%). Ở nồng độ chất khô cao, áp suất thẩm thấu tăng gây khó khăn cho sự trao đổi chất của tế bào nấm men và môi trƣờng. Dung dịch lên men có tính ƣu trƣơng, làm tế bào bị co lại, gây cản trở cho con đƣờng trao đổi chất của tế bào. Mặt khác, nồng độ chất khô cao thì độ nhớt của dịch mía lên men cũng tăng, quá trình di chuyển của các hợp chất trong dịch chậm, gây ức chế cho tế bào và tăng thời gian lên men. Do đó, ta chọn độ Brix 20% để lên men vì đây không những là độ Brix gần với độ Brix tự nhiên của nƣớc mía (từ 19 – 21%) mà còn cho lƣợng ethanol tạo thành cao và hiệu suất lên men cao.
SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 48
4.3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống
Bảng 4. 8: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ giống đến khả năng lên men
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ giống đến khả năng lên men Tỉ lệ
giống
Đƣờng tổng
ban đầu Chuyển hóa Ethanol tạo thành
Hiệu suất lên men Sản lƣợng % mg/ml % %v/v g/100ml % % 5 156.72 92.82 11.09 8.75 60.15 55.83 10 96.35 11.46 9.04 59.87 57.68 15 94.01 10.93 8.62 58.50 55.00 20 94.49 10.59 8.36 56.45 53.34
Đồ thị 4. 8: Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống đến khả năng lên men
Khi khảo sát tỷ lệ giống thích hợp để lên men dung dịch nƣớc mía có pH4, Brix
20%, ở nhiệt độ 30oC ta thấy tỉ lệ giống 10% cho kết quả lên men tốt nhất trong
khoảng khảo sát từ 5 – 20%. Kết quả lƣợng ethanol sinh ra lần lƣợt là 11.09, 11.46, 10.93 và 10.59% v/v tƣơng ứng với tỷ lệ giống 5, 10, 15 và 20%. Theo đồ thị hình 4.8, tỷ lệ giống 10% cho kết quả lên men tốt hơn hẳn so với 3 tỷ lệ giống khác đƣợc khảo sát cùng. Khi tăng tỷ lệ giống lên 15% và đặc biệt ở tỷ lệ giống 20%, lƣợng ethanol
SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 49
sinh ra giảm mạnh. Trong khi đó, tỷ lệ giống 5% cho kết quả sản xuất ethanol là khá cao.
Ở tỷ lệ giống 5%, lƣợng giống thấp nên chƣa đủ để lên men hết lƣợng đƣờng trong môi trƣờng nhƣng đã bị lƣợng ethanol sinh ra ức chế. Khi sử dụng lƣợng giống 5%, hiệu suất chuyển hóa thấp hơn các tỷ lệ giống còn lại. Điều này gây lãng phí một lƣợng lớn đƣờng trong dung dịch. Trong khi đó, nếu tăng lƣợng giống lên quá cao thì phần lớn lƣợng đƣờng trong dịch lên men đƣợc nấm men sử dụng để tăng sinh trong giai đoạn hiếu khí ban đầu do đó làm giảm đáng kể lƣợng ethanol sinh ra. Việc tăng tỷ lệ giống còn làm tăng chi phí sản xuất nấm men cố định, không có hiệu quả kinh tế.
Tỷ lệ giống 10% là tỷ lệ giống tốt nhất mà ta khảo sát đƣợc trong trƣờng hợp này để lên men dịch mía với các điều kiện đã nêu trên. Ở tỷ lệ giống này, lƣợng nấm men vừa đủ để lên men gần hết lƣợng đƣờng trong dung dịch mà không phải tốn quá nhiều đƣờng để tăng sinh nấm men ban đầu. Cũng nhƣ không bỏ sót quá nhiều đƣờng trong quá trình lên men. Ta chọn tỷ lệ giống 10% để khảo sát tiếp các điều kiện sau.
4.3.4. Ảnh hƣởng của pH
Bảng 4. 9: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đến khả năng lên men
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đến khả năng lên men
pH Đƣờng tổng
ban đầu Chuyển hóa Ethanol tạo thành
Hiệu suất lên men Sản lƣợng mg/ml % %v/v g/100ml % % 3.50