4. Tính mới của đề tài
2.2.4 Phƣơng pháp kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng
Các chủng vi sinh vật đƣợc hoạt hóa trên môi trƣờng đặc và cấy trên môi trƣờng Czapek- Dox (cho nấm sợi), Hansen (cho nấm men), MPA cho vi khuẩn và Sabouraud nuôi cấy nấm men Candida albican và nấm mốc Trychophytol mentargrohytes . Bào tử nấm sợi và sinh khối nấm men, vi khuẩn đƣợc pha loãng trong nƣớc muối sinh lý 0,9%. Mật độ vi sinh vật khoảng 108
CFU/ml bằng phƣơng pháp so sánh độ đục với ống chuẩn 0,5 McFarland (108 CFU/ml) hoặc tiến hành đo quang ở bƣớc sóng 550 nm, DO = 0,125. Để đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng chúng tôi tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp [133].
Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Vi sinh vật đƣợc hoạt hóa trong môi trƣờng lỏng 24 giờ ở 30o
C.
Cấy vi sinh vật vào môi trƣờng mới có bổ sung tinh dầu với mật độ cuối cùng khoảng 106
CFU/ml. Ống đối chứng không bổ sung tinh dầu. Sau 24h, lấy 100 l mỗi chủng cấy trải lên đĩa petri có môi trƣờng tƣơng ứng với vi sinh vật (không có tinh dầu). Sau 24h-36h nuôi cấy ở nhiệt độ 300C, đánh giá sự phát triển của vi sinh vật bằng cách xác định số lƣợng khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng đặc
Khả năng ức chế đƣợc tính theo công thức:
% ức chế = (1 - T/C) x 100 Trong đó : T là CFU/ml mẫu thử nghiệm
C là CFU/ml đối chứng
Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các loại tinh dầu nghệ bằng đĩa giấy khuyếch tán [38, 107, 108, 133, 148]
Tinh dầu đƣợc pha loãng các nồng độ trong dung dịch etylenglycol có bổ sung 0,1% Tween-20.
Dùng pipet lấy 20µl tinh dầu nghệ vàng có nồng độ khác nhau đƣa lên tấm giấy lọc vô trùng có đƣờng kính 0,5cm. Các tấm giấy lọc này đƣợc đặt trên môi trƣờng đã cấy trải vi sinh vật với mật độ khoảng 108
CFU/ml và nuôi 24h ở 30oC. Hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ mạnh hay yếu tùy thuộc vào đƣờng kính vòng kháng khuẩn lớn hay nhỏ. Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành xác định đƣờng kính vòng kháng khuẩn và kết luận. Mỗi
t nhắc lại ít nhất 3
Có thể phân loại độ nhạy cảm của tinh dầu đối với vi sinh vật dựa vào kích thƣớc vòng kháng khuẩn Zanil và Junior nhƣ sau :
+ không mẫn cảm (-) : D <8 mm + mẫn cảm (+) : D = 9- 12 mm + rất mẫn cảm (++): D= 13-18 mm + cực kỳ mẫn cảm (+++): D > 18 mm
Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng trên Cam
Qui trình xử lý quả trƣớc thí nghiệm: cam Hà Giang đƣợc rửa sạch bằng nƣớc. Sau
đó đƣợc tráng qua nƣớc H2O2 1% để loại bỏ các vi sinh vật bám trên vỏ quả.
- Quá trình lây nhiễm: Sử dụng nƣớc muối sinh lý 0,9% để pha loãng sinh khối nấm men thuộc chi Rhodoturola và bảo tử nấm mốc thuộc chi Valsa, Fusarium oxysporum với mật độ vi sinh vật khoảng 105
lần. Nhúng quả vào dung dịch với thời gian 5 phút để tạo điều kiện cho vi sinh vật có khả năng bám dính trên quả. Sau đó để khô tự nhiên.
- Quá trình xử lý: Nhúng quả vào tinh dầu nghệ vàng 1 phút với nồng độ 0,5% và 1%. Sau đó để khô khoảng 20 phút rồi đặt lên khay, bảo quản quả trong hộp cacton sạch ở điều kiện nhiệt độ thƣờng (27 ± 2ºC). Theo dõi, quan sát và mô tả hiện trạng quả theo thời gian.
Hình 2. 1: Quy trình đánh giá khả năng kháng vi sinh của tinh dầu nghệ vàng trên cam