4. Tính mới của đề tài
2.2.2Phƣơng pháp tách phân đoạn tinh dầu nghệ vàng
Tinh dầu nghệ vàng đƣợc tách thành
Phƣơng pháp làm giàu các cấu tử để thu đƣợc các phân đoạn khác nhau của tinh dầu.
Hệ thống thiết bị gồm bộ cất có 2 bình thủy tinh, một sinh hàn thẳng, áp kế, một bình cất, một bình thu, bơm hút chân không và bộ ổn nhiệt. Tinh dầu nghệ cất lôi cuốn hơi nƣớc đƣợc cho vào bình cất 2 cổ, lắp vào hệ thống cất, các nút nhám đƣợc bôi dầu chân không, nƣớc sinh hàn có nhiệt độ < 20o
C [38].
2.2.3 Phƣơng pháp xác định chỉ số hóa lý và phân tích thành phần của tinh dầu nghệ vàng
2.2.3.1 Xác định các chỉ số hóa lý của tinh dầu
a. Xác định độ trong, màu sắc và mùi vị của tinh dầu theo TCVN 8460:2010 [24]
Độ trong, màu sắc và mùi vị của tinh dầu là một chỉ tiêu quan trọng trong quá trình nghiên cứu về tinh dầu. Để xác định chỉ tiêu này thƣờng sử dụng các dụng cụ và hóa chất nhƣ: Ống nghiệm thủy tinh trong suốt có đƣờng kính 20- 25mm, dung tích 10ml, cân kỹ thuật, ống hút, giấy thấm và đƣờng kính trắng.
b. Xác định tỷ trọng của tinh dầu theo TCVN 8444:2010 [24]
Tỷ trọng của tinh dầu là tỷ số giữa khối lƣợng của một thể tích tinh dầu xác định ở 20oC với khối lƣợng của cùng một thể tích nƣớc cất cũng ở 20oC. Tỉ trọng của tinh dầu ở 20oC đƣợc tính theo công thức: d= m m m m 1 2 Trong đó: m - khối lƣợng bình tỉ trọng, g; m1 - khối lƣợng bình tỉ trọng và nƣớc ở 20oC, g; m2 - khối lƣợng bình tỉ trọng và tinh dầu ở 20oC, g.
Kết quả là trung bình cộng của hai lần xác định liên tiếp có sai lệch giá trị không lớn hơn 0,001 và đƣợc làm tròn tới số thập phân thứ tƣ.
Tinh dầu thƣờng là chất có hoạt động quang học, nghĩa là có đặc tính làm quay mặt phẳng phân cực của chùm tia sáng phân cực truyền qua. Khả năng phân cực của mỗi tinh dầu khác nhau và tùy thuộc vào cấu tử của tinh dầu, độ dài sóng của ánh sáng chiếu qua, nhiệt độ lúc đo và đƣợc biểu thị bằng năng suất quay cực, ký hiệu là α. Góc quay cực đƣợc xác định ở nhiệt độ phòng.
d. Xác định chỉ số khúc xạ theo TCVN 8445:2010 [24]
Chỉ số khúc xạ là tỷ số giữa sin của góc tới với sin của góc khúc xạ. Khi một chùm tia sáng đi từ môi trƣờng không khí qua môi trƣờng tinh dầu nào đó, tia sáng sẽ bị gẫy khúc, đó là hiện tƣợng khúc xạ ánh sáng. Đối với mỗi tinh dầu tỉ số giữa sin của góc tới và sin của góc khúc xạ là một hằng số và nó cùng bằng tỉ số vận tốc ánh sáng trong môi trƣờng không khí và môi trƣờng tinh dầu. Chỉ số khúc xạ đƣợc xác định ở 20o
C, theo phƣơng pháp đo góc tới hạn bằng khúc xạ kế. Nếu đo chỉ số khúc xạ ở nhiệt độ khác 20o
C hoặc 25oC thì n20D hoặc n25D đƣợc tính theo công thức nhƣ sau:
n20 D = nt D + (t – 20). 0,0004 Trong đó: nt D: Chỉ số khúc xạ ở nhiệt độ t lúc đo t: Nhiệt độ lúc đo
0.0004: Hệ số điều chỉnh khi nhiệt độ tăng hoặc giảm 1oC
e. Xác định chỉ số axit theo TCVN 8450:2010 [24]
Cân 2gam tinh dầu vào bình cầu xà phòng hóa. Thêm vào đó 10 ml ethanol và 5 giọt chỉ thị phenolphtalein chuẩn độ bằng KOH 0,1N trong ethanol cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong khoảng 30 giây. Chỉ số axit đƣợc tính kết quả nhƣ sau:
Chỉ số axit (X1) đƣợc tính theo công thức:
m V X1 5,61.
Trong đó:
V – lƣợng dung dịch KOH 0,1N đã dùng để chuẩn độ, ml; m – khối lƣợng mẫu thử, g;
5,61 – lƣợng KOH có trong ethanol, tính bằng mg.
f. Xác định chỉ số ester theo TCVN 8451:2010 [24]
- Dùng buret cho 20 ml dung dịch KOH 0,5N vào bình cầu để xà phòng hóa có chứa lƣợng mẫu đã xác định chỉ số axit lắp ống sinh hàn khí và đun sôi nhẹ trong 1 giờ. Cùng một lúc trong bình cầu khác kiểm tra song song một mẫu trắng gồm 10 ml etanol và 20 ml
dung dịch KOH 0,5N trong cồn. Đun xong, để nguội cho cả 2 bình mỗi bình 5 giọt chỉ thị màu phenolphetalein 2% (hoặc đỏ phenol). Chuẩn độ bằng dung dịch axit sunfuric 0,5N.
Chỉ số este (X2) đƣợc tính bằng công thức: m V V X ( 1).28,05 2 Trong đó:
V – lƣợng dung dịch axit sunfuric 0,5N đã dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml) V1 - lƣợng dung dịch axit sunfuric 0,5N đã dùng để chuẩn độ mẫu thử (ml) m – khối lƣợng mẫu, g;
28,05 – lƣợng KOH 0,5N.
2.2.3.2 Phân tích thành phần tinh dầu
Thành phần tinh dầu đƣợc phân tích (GC-MS) với các điều kiện nhƣ sau:
Các chất đƣợc tách bằng cột mao quản và nhận biết bằng detector chọn khối (MSD). Máy GC-System HP6890 MSD 5973 Aglilent ghép trực tiếp với máy sắc ký HP5980 Series II. Máy hoạt động theo chƣơng trình nhiệt độ: nhiệt độ 65oC giữ 2 phút, tăng nhiệt độ
5oC/phút đến 90oC giữ 3 phút, tăng 20oC /phút đến 103oC, giữ ở 103oC 3 phút, tăng nhiệt độ 8oC /phút tới 150oC, giữ ở 150oC 15 phút và tăng 20oC /phút tới 280o
C. Điều kiện MS: ion hóa mẫu ở thế ion hóa 7,10ev, nhiệt độ duy trì 250o
C, khí mang là heli tốc độ 1,0 ml/phút, tốc độ chia dòng 1:50.
Wiley [41, 44, 84, 109, 132, 145]
2.2.4 Phƣơng pháp kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng
Các chủng vi sinh vật đƣợc hoạt hóa trên môi trƣờng đặc và cấy trên môi trƣờng Czapek- Dox (cho nấm sợi), Hansen (cho nấm men), MPA cho vi khuẩn và Sabouraud nuôi cấy nấm men Candida albican và nấm mốc Trychophytol mentargrohytes . Bào tử nấm sợi và sinh khối nấm men, vi khuẩn đƣợc pha loãng trong nƣớc muối sinh lý 0,9%. Mật độ vi sinh vật khoảng 108
CFU/ml bằng phƣơng pháp so sánh độ đục với ống chuẩn 0,5 McFarland (108 CFU/ml) hoặc tiến hành đo quang ở bƣớc sóng 550 nm, DO = 0,125. Để đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng chúng tôi tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp [133].
Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Vi sinh vật đƣợc hoạt hóa trong môi trƣờng lỏng 24 giờ ở 30o
C.
Cấy vi sinh vật vào môi trƣờng mới có bổ sung tinh dầu với mật độ cuối cùng khoảng 106
CFU/ml. Ống đối chứng không bổ sung tinh dầu. Sau 24h, lấy 100 l mỗi chủng cấy trải lên đĩa petri có môi trƣờng tƣơng ứng với vi sinh vật (không có tinh dầu). Sau 24h-36h nuôi cấy ở nhiệt độ 300C, đánh giá sự phát triển của vi sinh vật bằng cách xác định số lƣợng khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng đặc
Khả năng ức chế đƣợc tính theo công thức:
% ức chế = (1 - T/C) x 100 Trong đó : T là CFU/ml mẫu thử nghiệm
C là CFU/ml đối chứng
Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các loại tinh dầu nghệ bằng đĩa giấy khuyếch tán [38, 107, 108, 133, 148]
Tinh dầu đƣợc pha loãng các nồng độ trong dung dịch etylenglycol có bổ sung 0,1% Tween-20.
Dùng pipet lấy 20µl tinh dầu nghệ vàng có nồng độ khác nhau đƣa lên tấm giấy lọc vô trùng có đƣờng kính 0,5cm. Các tấm giấy lọc này đƣợc đặt trên môi trƣờng đã cấy trải vi sinh vật với mật độ khoảng 108
CFU/ml và nuôi 24h ở 30oC. Hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ mạnh hay yếu tùy thuộc vào đƣờng kính vòng kháng khuẩn lớn hay nhỏ. Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành xác định đƣờng kính vòng kháng khuẩn và kết luận. Mỗi
t nhắc lại ít nhất 3
Có thể phân loại độ nhạy cảm của tinh dầu đối với vi sinh vật dựa vào kích thƣớc vòng kháng khuẩn Zanil và Junior nhƣ sau :
+ không mẫn cảm (-) : D <8 mm + mẫn cảm (+) : D = 9- 12 mm + rất mẫn cảm (++): D= 13-18 mm + cực kỳ mẫn cảm (+++): D > 18 mm
Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng trên Cam
Qui trình xử lý quả trƣớc thí nghiệm: cam Hà Giang đƣợc rửa sạch bằng nƣớc. Sau
đó đƣợc tráng qua nƣớc H2O2 1% để loại bỏ các vi sinh vật bám trên vỏ quả.
- Quá trình lây nhiễm: Sử dụng nƣớc muối sinh lý 0,9% để pha loãng sinh khối nấm men thuộc chi Rhodoturola và bảo tử nấm mốc thuộc chi Valsa, Fusarium oxysporum với mật độ vi sinh vật khoảng 105
lần. Nhúng quả vào dung dịch với thời gian 5 phút để tạo điều kiện cho vi sinh vật có khả năng bám dính trên quả. Sau đó để khô tự nhiên.
- Quá trình xử lý: Nhúng quả vào tinh dầu nghệ vàng 1 phút với nồng độ 0,5% và 1%. Sau đó để khô khoảng 20 phút rồi đặt lên khay, bảo quản quả trong hộp cacton sạch ở điều kiện nhiệt độ thƣờng (27 ± 2ºC). Theo dõi, quan sát và mô tả hiện trạng quả theo thời gian.
Hình 2. 1: Quy trình đánh giá khả năng kháng vi sinh của tinh dầu nghệ vàng trên cam
2.2.5 Xây dựng qui trình bảo quản cam Hà Giang ở quy mô phòng thí nghiệm
Cam đƣợc thu mua tại cùng một vƣờn, ở các cây 7 tuổi, có chế độ chăm sóc tƣơng tự nhƣ nhau, thu hoạch vào thời điểm khô, mát không có sƣơng mù. Hái từng quả một. Sau đó xếp cam vào thùng carton có khoét nhiều lỗ thông thoáng, lót giấy mềm xung quanh và dƣới đáy. Lúc đặt cam vào thùng, tránh để cuống đâm vào các quả khác. Vận chuyển bằng xe về nơi bố trí thí nghiệm. Trong quá trình thu hái, vận chuyển, quả không tiếp xúc trực tiếp với đất hay ánh nắng mặt trời.
- Bố trí thí nghiệm : Cam sau khi đƣa về phòng thí nghiệm đƣợc lựa chọn và phân loại, chọn những quả không bị bầm dập, xây xát, không bị chọc thủng, cuống cắt sát núm quả và loại bỏ các quả quá to hoặc quá nhỏ. Cam đủ tiêu chuẩn làm thí nghiệm sẽ đƣợc bố trí ngẫu
Mẫu đối chứng Mẫu xử lý bằng tinh dầu
Bảo quản
Đánh giá kết quả Lây nhiễm vi sinh vật
Rửa sạch Cam sau thu hoạch
nhiên theo 6 công thức. Mỗi công thức gồm 40 quả, trong đó có 20 quả đƣợc khoanh tròn và đánh số thứ tự từ 1 đến 20.
ĐC: Đối chứng không xử lý chế phẩm ở nhiệt độ phòng CT1: Mẫu xử lý bằng chế phẩm ở nhiệt độ phòng CT2: Mẫu xử lý bằng tinh dầu 0,5% ở nhiệt độ phòng
CT3: Mẫu xử lý bằng chế phẩm + tinh dầu 0,5% ở nhiệt độ phòng CT4: Đối chứng không xử lý chế phẩm ở nhiệt độ 8 ± 2o
C CT5: Mẫu xử lý bằng chế phẩm + tinh dầu 0,5% ở nhiệt độ 8 ± 2o
C
(Thành phần chế phẩm gồm: acid stearic, acid citric, glycerol, gelatin, tween-80, CaCl2) - Toàn bộ các công thức đƣợc thực hiện trong cùng thời điểm.
- Tiến hành theo dõi, lấy mẫu ngẫu nhiên và phân tích định kỳ 5 ngày một lần (mỗi lô lấy mẫu ngẫu nhiên 3 điểm cho một định kỳ theo dõi).
- Thời gian bảo quản theo dõi là 30 ngày.
2.2.6 Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình bảo quản bằng chế phẩm tinh dầu nghệ vàng phẩm tinh dầu nghệ vàng
- Mẫu phân tích hóa sinh đƣợc lấy ngẫu nhiên trong số 20 quả không khoanh tròn ở các công thức và định kỳ 3 quả/công thức/lần phân tích.
- Mẫu phân tích cơ lý là 20 quả đƣợc đánh số và khoanh tròn trong từng công thức. a. Xác định tỷ lệ tổn thất khối lượng tự nhiên
Tỷ lệ tổn thất khối lƣợng đƣợc tính theo công thức: X(%) = [(M1-M2)/M1]x100, trong đó M1(g) là khối lƣợng quả trƣớc bảo quản và M2(g) là khối lƣợng quả sau phân tích. Tỷ lệ thối hỏng quả đƣợc tính công thức: X(%) = [M2:M1]x100, trong đó M1 là tổng số quả theo dõi, M2 là tổng số quả thối hỏng sau các lần kiểm tra định kỳ.
b. Xác định sự biến đổi màu sắc vỏ quả qua từng giai đoạn bằng máy đo màu Color Meter
Máy đo dựa trên nguyên tắc sự phản xạ ánh sáng từ bề mặt quả tới bộ phận quang phổ của máy. Màu sắc của quả đƣợc thể hiện thông qua các chỉ số L- a - b trong đó:
L: có giá trị từ 0 (total black - tối đen) đến +100 (pure white - trắng tinh) a: có giá trị từ - 60 (green - xanh lá cây) đến +60 (red - đỏ)
b: có giá trị từ - 60 (blue - xanh da trời) đến +60 (yellow – vàng) Độ biến đổi màu sắc của quả đƣợc xác định bằng công thức:
∆E = [(Li- Lo)2 + (ai - ao)2 + (bi - bo) 2]1/2 Trong đó:
- Lo , ao, bo là kết quả đo màu của nguyên liệu đầu vào
c. Xác định hàm lượng vitamin C (TCVN 6427 – 2: 1998)
Lấy 10ml dịch quả cho vào bình tam giác 250ml, cho 5ml dung dịch H2SO4 và thêm vài giọt tinh bột 0,5%, lắc nhẹ rồi chuẩn độ bằng I2 0,01N tới khi bắt đầu xuất hiện màu xanh. Kết quả tính theo công thức:
Hàm lƣợng VTM C=
V n 0,88 1000
(mg%)
Trong đó: n: số ml dung dịch I2 0,01N dùng để chuẩn độ
0,88: số mg axit ascocbic tƣơng ứng với 1ml I2 0,01N V: số ml dịch quả lấy để phân tích
d. Xác định hàm lượng đường (TCVN 3948 – 84)
Máy đo chiết quang kế cầm tay có thể sử dụng để xác định hàm lƣợng đƣờng (tƣơng đƣơng với độ Brix) trong một mẫu nhỏ dịch quả. Nhiệt độ sẽ ảnh hƣởng đến kết quả đo nên cần điều chỉnh phép đo ở nhiệt độ thƣờng. Để có kết quả chính xác hơn cần làm sạch và chuẩn hóa máy đo giữa mỗi lần đọc kết quả bằng nƣớc cất.
e. Phương pháp xác định hàm lượng axit hữu cơ tổng số (TCVN 3948 – 84)
Từ các mẫu cam phân tích ở mỗi công thức ép lấy dịch quả và lọc trong. Dùng pipet hút 10ml dịch quả cho vào bình tam giác, thêm 20ml nƣớc cất và 5 giọt phenolftalein 1%. Tiến hành chuẩn dộ bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu phớt hồng. Hàm lƣợng axit đƣợc tính theo công thức:
X = (M x V2 x N x 100) / (V1 x 1000) Trong đó: X: Hàm lƣợng axit (%)
M: Phân tử lƣợng axit xitric = 64 N: Nồng độ dung dịch NaOH V1: Số ml dịch quả lấy để chuẩn độ V2: Số ml NaOH cần để chuẩn độ
f. Phương pháp đánh giá cảm quan bằng cho điểm thị hiếu
Đánh giá cảm quan đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp cho điểm thị hiếu. Sử dụng các giác quan để đánh giá các chỉ tiêu về hình thức bên ngoài, màu vỏ quả, màu thịt quả, mùi vị thịt quả. Tất cả các chỉ tiêu đều đƣợc đánh giá theo thang điểm 5 (0-5 điểm). Đánh giá cảm quan đƣợc tiến hành nhƣ sau: chuẩn bị phiếu trả lời, chuẩn bị mẫu, mã hóa mẫu, mời đánh giá, tổng hợp kết quả. Các mẫu đánh giá là ĐC, CT1, CT2, CT3 và đƣợc mã hóa tƣơng ứng là A, B, C, D. Hội đồng đánh giá cảm quan gồm 10 thành viên có cả nam và nữ, mỗi thành viên đƣợc phát một phiếu đánh giá cảm quan và các mẫu cam đã đƣợc mã
hóa, thứ tự các mẫu khi phát cho các thành viên của hội đồng là không giống nhau. Sau mỗi lần thử, các thành viên sử dụng nƣớc lọc để thanh vị trƣớc khi thử mẫu tiếp theo.
Bảng 2. 6: : Phiếu đánh giá cảm quan bằng phép thử cho điểm thị hiếu
g. Xác định độ bám dính của chế phẩm theo TCVN 2097:1993
Độ bám dính của màng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp cắt. Tiến hành cắt 3 điểm khác nhau trên bề mặt quả, khoảng cách nhau 1mm. Kết hợp xác định độ bám dính của màng và đo độ dầy màng bán thấm trên bề mặt quả bằng máy NiKKO – ECLIPSE. E600, với chƣơng trình IMAGE PROPUS. Chụp ảnh trên phần mềm ACT1, Camera DXM 1200 Niko Digital camera
2.2.7. Tối ƣu hóa quy trình sử dụng chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng trong bảo quản cam Hà Giang bằng phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm. quản cam Hà Giang bằng phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm.
Bố trí thí nghiệm đƣợc thực hiện theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken, với k=3. Có 17 thí nghiệm, trong đó có 5 thí nghiệm tại tâm nhƣ sau: