4. Tính mới của đề tài
3.6.1 Đánh giá khả năng ức chế sinh trƣởng nấm da của tinh dầu nghệ vàng
Đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh trên da của tinh dầu nghệ bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Các chủng nấm đƣợc phân lập từ nguồn bệnh tại Viện Da Liễu Trung Ƣơng và tiến hành cấy bào tử nấm mốc, sinh khối nấm men với mật độ khoảng 108 CFU/ml trên môi trƣờng sabourand. Tấm giấy lọc có đƣờng kính 5 mm đã khử trùng. Lấy 20µl tinh dầu nghệ vàng thô thấm vào giấy lọc và đặt lên đĩa thạch có cấy vi sinh vật thử nghiệm. Tƣơng tự nhƣ vậy, chuẩn bị tấm giấy lọc có kháng sinh tiêu chuẩn chứa
gentamycin 80μg và 10μg của streptomycin vô trùng làm đối chứng dƣơng để so sánh hoạt tính đối kháng nấm của tinh dầu nghệ. Các đĩa petri đƣợc ủ ở 300C trong 36 giờ. Kết quả thu đƣợc nhƣ trên bảng 3.28
Bảng 3. 28: Hoạt tính kháng nấm da của tinh dầu nghệ vàng
Chủng vi sinh vật Đƣờng kính vòng kháng (D-d),cm
Tinh dầu nghệ vàng Gentamycin Streptomycin
Candida albicans 2,5 ± 0,07 1,35 ± 0,05 1,5 ± 0,15
Trychophytol mentargrohytes
2,0 ± 0,23 1,1 ± 0,04 1,3 ± 0,01
Kết quả trên cho thấy, tinh dầu nghệ vàng có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên da rất tốt [148]. Tinh dầu thô cho đƣờng kính vòng kháng khuẩn 2,5 cm đối với Candida albicans và 2,0 cm đối với Trychophytol mentargrophytes, cao hơn so với 2 loại kháng
sinh đối chứng. Kết quả này cũng tƣơng tự với kết quả của Valero và cộng sự cho rằng các loại tinh dầu có nguồn gốc từ nhiều loài thực vật có hoạt tính kháng nấm da tốt [135]. Nhiều loại tinh dầu đã đƣợc thử nghiệm in vitro và in vivo cho thấy hoạt tính kháng nấm có thể đƣợc khai thác nhƣ thuốc kháng nấm tiềm năng [77]. Cơ chế hoạt động của tinh dầu tác động chủ yếu lên màng tế bào nấm, phá vỡ cấu trúc màng, ngăn chặn sự tổng hợp màng tế bào, ức chế sự nảy mầm bào tử, sự phát triển nấm và hô hấp tế bào [66, 67]. Sharma và cộng sự đã nghiên cứu thuốc thảo dƣợc có chứa bột thân rễ nghệ vàng chữa khỏi bệnh nấm ngoài da gây ra bởi Trychophyton verrucosum cho 12 con gia súc và Microsporum canis
cho 21 con chó trong vòng 12-15 ngày điều trị [122].
Ảnh hƣởng của các nồng độ tinh dầu nghệ vàng khác nhau tới sinh trƣởng của hai loại nấm nghiên cứu đã đƣợc xác định (bảng 3.29)
Bảng 3. 29: Ảnh hưởng nồng độ tinh dầu nghệ vàng lên sinh trưởng các chủng nấm da nghiên cứu
Nồng độ tinh dầu (%) Đƣờng kính đối kháng (D-d), mm
Candida albicans Trychophytol mentargrohytes
0 0,0 0,0 0,3 0,3 ± 0,37 0,2 ± 0,11 0,5 1,6 ± 0,28 0,9 ± 0,18 0,7 1,7 ± 0,54 1,4 ± 0,15 1,0 1,8 ± 0,32 1,6 ± 0,18 1,5 2,2 ± 0,58 1,9 ± 0,08 2,0 2,6 ± 0,71 2,2 ± 0,13 2,5 3,0 ± 1,73 2,6 ± 0,11 3,0 3,3 ± 1,03 3,1 ± 0,17
Tin đã bắt đầu thể hiện hoạt tính ức chế sinh trƣởng của Candida albicans, và Trychophytol mentargrohytes nhƣng không rõ ràng,
đƣờng kính vòng kháng nấm nhỏ và rất mờ. Theo nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới, kh không chỉ tinh dầu nghệ vàng, mà tinh dầu một số loại nhƣ tỏi, đinh hƣơng, quế…đều tăng theo sự tăng của n [76]. Kết quả bảng 3.29 nhận đƣợc cho thấy, nồng độ ức chế tối thiểu của tinh dầu nghệ thu đƣợc bằng phƣơng pháp LCHN là 0,5% cho Candida albicans và 0,7% cho Trychophytol mentargrohytes [148]. Kết quả này cũng tƣơng tự của Wuthi-udomlert và cộng sự đánh giá
hoạt tính đối kháng nấm da của tinh dầu nghệ [139]. Điều này cho thấy việc sử dụng tinh dầu nghệ trong việc điều trị nhiễm nấm da là rất khả quan và đã có một số nghiên cứu tiền lâm sàng đƣợc tiến hành với thuốc mỡ có chứa tinh dầu của Trachyspermum ammi [70] và
Curcuma longa [40].
3.6.2 da của tinh dầu nghệ vàng
Để xác định thời gian tối thiểu tinh dầu nghệ có thể tiêu diệt hoàn toàn các chủng nấm nghiên cứu, thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau: các chủng nấm đƣợc nuôi trong môi trƣờng lỏng mật độ 108
CFU/ml, bổ sung tinh dầu nghệ vàng nồng độ 0,5 % cho C. albicans và 0,7% cho T. mentagrophyte. Sau các khoảng thời gian nhất định, cấy trải 20 µl canh trƣờng nuôi lên đĩa petri có môi trƣờng sabouraud. Xác định số khuẩn lạc phát triển (bảng 3.30).
Bảng 3. 30: Ảnh hưởng của thời gian phơi nhiễm lên khả năng diệt nấm của tinh dầu nghệ vàng
khuẩn lạc (CFU/ml) Thời gian( phút) Candida albicans Trychophytol mentargrohytes 0 8,6.103 7,48.103 5 5,36. 103 5,54.103 10 2,96. 103 3,36.103 15 2,08. 103 3.103 20 1,76. 103 2,52.103 25 1,48. 103 1,92.103 30 0,2. 103 0,84.103 45 0,12. 103 0,56.103
60 0 0,4.103
90 0 0
120 0 0
Kết quả thí nghiệm ở bảng 3.30 và hình 3. 36, 3.37 đối với 2 chủng nấm gây bệnh trên da C. albicans và T. mentagrophytes cho C. albicans bị tiêu diệt hoàn toàn sau 1 giờ ủ với tinh dầu nghệ, và T. mentagrophytes chịu đƣợc tác động của tinh dầu nghệ tốt hơn. Loài này chỉ bị tiêu diệt hoàn toàn sau 90 phút ủ với tinh dầu nghệ.
Một số nghiên cứu đánh giá hoạt tính và cơ chế của tinh dầu tác động đến nấm da nhƣ Pintovà cộng sự thấy rằng tinh dầu Thymus pulegioides nồng độ 0,08 µg/ml làm giảm hàm lƣợng ergosterol của loài T. rubrum xuống 70% [107]. Cơ chế hoạt động dựa trên suy giảm sinh tổng hợp ergosterol đã đƣợc giả thuyết nhƣ với thuốc kháng nấm azole [76]. Inouye và cộng sự bằng kính hiển vi điện tử quan sát thấy tinh dầu phá hủy màng tế bào và thành tế bào phụ thuộc vào nồng độ và thời gian tiếp xúc [71]. Park đã phân tích cơ chế hoạt động của eugenol, một hợp chất chính trong tinh dầu Syzygium aromaticum với loài T.
mentagrophytes và quan sát thấy sự phá hủy màng ty thể bên trong, vách tế bào, mạng
lƣới nội chất gần màng tế bào. Đây là cơ chế tác động thông qua sự thay đổi cấu trúc tế bào ở màng [102, 104]. Bajpai và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm bào tử của các loài T. rubrum, M. canis, T. mentagrophytes với tinh dầu Nandina domestica cho thấy hiệu quả
tác động rất mạnh và cũng phụ thuộc rất nhiều vào thời gian tiếp xúc [40].