3.6.4.1 Định nghĩa, nguyên tắc
Phương pháp ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assay) hay phương pháp thử miễn dịch dùng men ( Enzyme Immuno Assay, EIA) dựa cơ sở sử dụng một thể tiếp hợp chứa kháng thể đặc hiệu với một kháng nguyên và được gắn với một loại
enzyme nhất định. Tiền đề cho phương pháp này là hoạt tính của cả kháng nguyên (hoặc kháng thể) lẫn của enzyme khi liên kết với nhau trong thể tiếp hợp đều không chịu sự thay đổi nào đáng kể. Enzyme liên kết trong thể tiếp hợp xúc tác cho một phản ứng hóa học, phản ứng này sinh ra một chất có màu từ cơ chất không màu. Sản phẩm có màu này có thể tan hoặc không tan tùy thuộc vào tác nhân phản ứng được lựa chọn dùng cho enzyme nói trên và phương thức miễn dịch. Sản phẩm có màu này có thể phát hiện bằng mắt thường khi cần kết quả định tính hoặc có thể đo bằng quang phổ kế khi cần kết quả định lượng. Các enzyme tiêu biểu thường dùng là peroxidase, phosphatase kiềm...
3.6.4.2 Quy trình phân tích
Chủng bị bề mặt ( microtiter) có gắn kháng thể
Rửa đĩa, kháng nguyên không được gắn kết sẽ bị rửa trôi Phủ mẫu chứa kháng nguyên cần xác định
Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt
Thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn với enzyme
Thêm các kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần chuẩn đoán
Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi
Hình 3.11: Dạng bánh kẹp gồm kháng thể bắt – kháng nguyên – thể tiếp hợp chứa kháng thể [13]
3.6.4.3 Thuyết minh quy trình
Mẫu hoặc dịch chiết mẫu được tiếp xúc với chất mang, đáy ống nghiệm hoặc khuôn lõm có gắn kháng thể. Sau đó được ủ ở370C trong 20 – 24 giờ để kháng nguyên ( nếu có) kết hợp với kháng thể bắt ( capture antibody). Sau đó người ta rửa đĩa, kháng nguyên không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Sau đó, ta thêm các kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần chuẩn đoán. Tiếp theo ta thêm kháng thể thứ cấp
đã được gắn kết với enzyme và đem ủ ở 250C trong 2 giờ. Kế tiếp, người ta đổ dịch thế tiếp hợp đi, lại rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi. Và cho dung dịch chứa cơ chất của enzyme vào. Sau 30 phút ở nhiệt độ phòng, thì dừng phản ứng lại và màu sắc hiện ra được quan sát bằng mắt thường hoặc được đo bằng quảng phổ kế ở bước sóng 450nm. Nếu kháng nguyên có trong mẫu, một dạng bánh kẹp gồm: kháng thể bắt – kháng nguyên – thể tiếp hợp chứa kháng thể phát hiện được hình thành trên bề mặt chất mang, trong ống nghiệm hoặc khuôn lõm. Enzyme của thể tiếp hợp sẽ tạo ra một sản phẩm có màu từ cơ chất được đưa vào. Trong trường hợp không có kháng nguyên, thể tiếp hợp chứa kháng thể phát hiện sẽ không gắn với chất mang, đáy ống nghiệm hoặc
khuôn lõm, như vậy màu sẽ không hiện ra khi cho cơ chất của enzyme vào ( hình 3.11 và hình 3.12)