Ngày 09 tháng 05 năm 2011 đến ngày 26 tháng 06 năm 2011 3.2 Vật liệu
Mẫu thực phẩm chế biến sẵn.
3.2.1 Hóa chất – môi trường
Buffer Pepton Water (BPW)
Plate Count Agar (PCA)
Tryptone Soya Agar (TSA)
Violet Red Bile Agar ( VRB)
Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)
Eosine Methylene Blue Agar(EMB)
Canh trypton
Canh MR-VP
Thạch Simmon citrate Agar
Thuốc khử Kovac’s
Thuốc khử Methyl Red
Thuốc khử α- naphtol 5%
KOH 40%
Môi trường canh Escherichia coli Broth (EC)
Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar ( DRBC)
Môi trường canh LSB
3.2.2 Dụng cụ
Ống nghiệm không nắp
Ống nghiệm có nắp
Cân điện tử
Bình tam giác
Bình định mức
Cốc thủy tinh
Kéo
Đũa thủy tinh
Túi nilon vô khuẩn
Đèn cồn
Que cấy thẳng
Que cấy vòng
Bình chứa môi trường
Khăn giấy
Bông y tế
Bông không thấm nước
Pipetman 3.2.3 Thiết bị Autoclave Tủ lạnh Bếp từ Tủ ấm 44oC Tủ ấm 30oC Tủ ấm 37oC Tủ sấy 180oC Tủ cấy Bếp đun Bể ổn nhiệt
3.3.1 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu thực phẩm 3.3.1.1 Thu và chứa mẫu 3.3.1.1 Thu và chứa mẫu
Kết quả thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu. Kế hoạch lấy mẫu được áp dụng cho từng trường hợp cụ thể và được mang về
phòng thí nghiệm phản ánh đúng tình trạng mẫu cần phân tích
Dụng cụ thu mẫu thay đổi tùy loại sản phẩm. Trường hợp thực phẩm đông lạnh, có thể sử dụng các ống khoan tay vô trùng, dao đã được sát trùng để tách thành lượng mẫu cần thiết, sau đó dùng thìa, kéo… để cho mẫu vào trong dụng cụ chứa. Lưu ý tránh thu các mảng băng.
Trường hợp thực phẩm đã đóng gói thành nhiều mức, thực hiện thu mẫu bằng cách chọn lấy các gói lớn từ đó lấy ra các bao nhỏ hơn.
Khối lượng tổng cần thu của mỗi mẫu thay đổi tùy thuộc số lượng các chỉ tiêu cần phân tích nhưng ít nhất là khoảng 100 – 250g. Mẫu cần đảm bảo tính đại diện để có được khối lượng mẫu cần thiết, cần thu gộp mẫu tại nhiều vị trí trên nguyên liệu hay thành phẩm.
Trường hợp mẫu phân tích là bán thành phẩm đang được chế biến, cần thực hiện thu mẫu tại nhiều vị trí trong cùng một công đoạn. Đối với các loại mẫu như thịt hay cá, nơi nhiễm vi sinh vật chủ yếu là bề mặt. Do vậy, có thể sử dụng que bông vô trùng quét một diện tích bề mặt nhất định hay cắt lát với bề dày 2 - 3mm để thu mẫu.
Dụng cụ chứa mẫu thường là các bình nhựa có nắp bằng nhôm hay bằng chất dẻo, bao nylon chứa mẫu. Tránh sử dụng các bình bằng thủy tinh để chứa mẫu vì dễ vỡ.
3.3.1.2 Vận chuyển và bảo quản mẫu
Mẫu sau khi thu được bảo quản một cách độc lập với nhau trong các thùng bảo quản mẫu được làm lạnh bằng các bao nước đá. Nước đá phải không được tan chảy trong suốt quá trình vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm.
Tại phòng thí nghiệm mẫu được chuyển vào trong tủ đông và được phân tích ngay khi có thể. Nếu không phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản ở -20oC cho đến khi phân tích. Trường hợp mẫu không thể bảo quản đông thì có thể được bảo quản trong tủ
lạnh ở 0 – 4oC nhưng không được quá 36 giờ. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp hay thực phẩm khó hư hỏng có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích.
3.3.1.3 Chuẩn bị mẫu
Rã đông mẫu trước khi phân tích
Mẫu đông lạnh phải được giải đông trong điều kiện vô trùng trước khi được phân tích. Trường hợp phải phối trộn mẫu trước khi phân tích, mẫu phải được giải đông bên trong các dụng chứa đã được sử dụng để thu mẫu và chuyển mẫu về phòng thí nghiệm, không chuyển mẫu sang dụng cụ chứa khác.
Việc giải đông được thực hiện ở nhiệt độ 2 – 5oC trong khoảng 18 giờ. Khi cần thiết, có thể giải đông nhanh ở 45oC trong 15 phút. Trường hợp này, cần liên tục lắc bình chứa mẫu để làm tăng tốc độ giải đông và làm đồng nhất nhiệt độ bên trong mẫu.
Cân mẫu
Cân chính xác một lượng mẫu xác định để tiến hành phân tích tùy theo yêu cầu của chỉ tiêu phân tích với sai số cho phép là ±0,1g. Lượng mẫu này được cho vào trong các bình chứa bằng nhựa hay các bao nhựa vô trùng.
Với kỹ thuật đếm khuẩn lạc các mẫu cần phân tích được pha loãng liên tiếp và được xác định một vài nồng độ pha loãng nhất định để cấy vào các môi trường thích hợp. kỹ thuật pha loãng thường qua các bước như sau:
Dung dịch pha loãng mẫu: một số dung dịch dùng pha loãng có thể làm chết tế bào như nước muối nước cất.các dung dịch pha loãng sau khi lấy ra từ tủ lạnh không được dùng ngay vì có thể gây sóc cho vi sinh vật làm cho vi sinh vật không thể phát triển được
Chuẩn bị các chuỗi pha loãng: bơm chính xác 9ml dung dịch pha loãng vào ống nghiệm có nắp.
Mẫu cần phân tích là mẫu thực phẩm thao tác tiến hành pha loãng như sau: cân 25g mẫu thực phẩm cần phân tích cho vào túi dựng thêm vào túi 225ml dung dịch pha
dịch pha loãng lắc đều ta có 10-2 tương tự ta lấy 1ml 10-2 cho vào 9ml dung dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn ta có mẫu 10-3. Theo cách này ta làm cho đến khi có nồng độ pha loãng như mong muốn ( hình 3.1).
Hình 3.1 : Pha loãng mẫu [8] Đồng nhất mẫu
Do sự phân bố không đều của vi sinh vật bên trong mẫu nên mẫu cần được làm đồng nhất trước khi phân tích. Việc đồng nhất các mẫu lỏng được thực hiện bằng cách lắc kỹ trước khi phân tích. Các mẫu rắn được lắc hay đảo trộn bằng các dụng cụ chuyên dùng, ví dụ như: thiết bị dập mẫu (Stomacher), trong điều kiện vô trùng.
Pha loãng mẫu
Ống nuôi cấy ban đầu (ống gốc) 10-1 101 10-2 102 10-3 103 10-4 104 Pha loãng Độ pha loãng 10-5
Sau khi mẫu được đồng nhất, tùy yêu cầu của chi tiêu phân tích, thực hiện thu một lượng xác định của mẫu để tiến hành phân tích. Ví dụ, đối với các chỉ tiêu định lượng, lượng mẫu trích ra để phân tích là 10g, đối với các chỉ tiêu định tính, lượng mẫu trích ra để phân tích là 25g.
3.4 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí
3.4.1 Phương pháp đổ đĩa 3.4.1.1 Ý nghĩa 3.4.1.1 Ý nghĩa
Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo
quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản.
3.4.1.2 Nguyên tắc
Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng thành các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trường nuôi cấy. Các khuẩn lạc hình thành trong môi trường sau khi ủ được xem như chúng hình thành từ một tế bào riêng lẻ. Theo yêu cầu của tiêu chuẩn Việt Nam chỉ tiêu này được ủ 30oC trong 72 giờ ± 6 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ ± 6 giờ.
3.4.1.3 Môi trường sử dụng
- Môi trường pha loãng mẫu: Saline Pepton Water ( SPW) hoặc Buffer Pepton Water (BPW).
- Môi trường nuôi cấy : Plate Count Agar (PCA)
3.4.1.5 Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu.
Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1.
Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết.
Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất được độ pha loãng 10-1
Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý để được các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4.
Lật ngược đĩa ủ ở 30oC trong 72 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ
Từ mỗi độ pha loãng hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri đã vô trùng, đổ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 45oC. Mỗi độ pha loãng làm
2 đĩa.
Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25-250 để đếm
Cấy mẫu
Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4, dùng pipetman hút 1ml mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri đã khử trùng. Tiếp tục đỗ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng để nguội khoảng 45oC, lắc đều bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3-5 lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và chờ môi trường đặc lại, lật ngược đĩa ủ 30oC sau 72 giờ hoặc37oC trong 48 giờ (hình 3.2). Chọn tất cả đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 khuẩn lạc để đếm
Hình 3.2 Phương pháp thực hiện đổ đĩa phân tích tổng vi sinh hiếu khí [10]
Đĩa petri vô trùng PCA 45oC 10 -15 ml Dung dịch mẫu đã pha loãng 1 ml
Lắc đều đĩa petri Để nguội Lật n gược đĩa Ủ 30oC/3 ngày Đếm số khuẩn lạc và tính kết quả
Hình 3.3 : Tổng số vi sinh vật hiếu khí [10] - Nếu ở nồng độ pha loãng cao
nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa lớn hơn 250. Ví dụ: ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2,5x107 CFU/ml
- Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa nhỏ hơn 25. Ví dụ: ở nồng độ 10-1 số đếm được nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2,5x102 CFU/ml
- Khuẩn lạc mọc loang tính là 1 khuẩn lạc
Công thức tính kết quả
Đếm tất cả các số khuẩn lạc xuất hiện trên các khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25- 250 để tính kết quả. Mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu được tính theo cong thức sau
Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc ) trong 1g mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường fi: Độ pha loãng tương ứng
Ví dụ: Trong 1 trường hợp phân tích 1g mẫu cụ thể nhận được kết quả như sau:
Kết quả: Nồng độ pha loãng 10-3 10-4 10-5
Đĩa 1 235 26 16 Đĩa 2 246 21 10 (cfu/g) ... 1 1 1 V f ni Vi fi n N A
) / ( 10 . 4 , 2 0001 , 0 . 1 . 1 001 , 0 . 1 . 2 26 246 235 5 g CFU A 3.5 Định lượng tổng số Coliforms 3.5.1 Phương pháp đổ đĩa 3.5.1.1 Ý nghĩa
Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản.
3.5.1.2 Nguyên tắc
Mẫu đã được đồng nhất hoá được cấy 1 lượng nhất định trên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ ở 37 10C trong 24 – 48 giờ. Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho Coliforms còn
chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị pH như Neutral red, crystal.
Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính >
0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật. Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL.
Mật độ Coliforms được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỷ lệ
khẳng định và độ pha loãng trước khi cấy vào đĩa.
Để phát hiện được bộ phận tế bào Coliforms bị tổn thương hay bị giảm sức sống
do quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không tăng trưởng được trong môi trường chọn lọc, trước khi mẫu được cấy vào một môi trường không chọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc.
3.5.1.4 Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu.
Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1.
Đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đếm đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, có đường kính > 5mm
Xác định tỷ lệ R. Tính kết quả. ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ
Chọn 3-5 khuẩn lạc của 2 đĩa cấy vào 5 ống BGBL Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây
Lấy 1ml mẫu trên cho vào 2 đĩa Petri trống đã vô trùng
Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ
Đỗ khoảng 15ml môi trường VRB đã đun tan và làm nguội 45oC Đỗ khoảng 5ml TSA tan chảy và làm nguội đến 45oC, lắc đều
Hình 3.4: Khuẩn lạc Coliforms [8]
Cấy mẫu.
Dùng pipetman hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri trống. Đỗ khoảng 5ml môi trường TSA đã hấp khử trùng để nguôị 45oC, lắc đều để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ. Gai đoạn này nhầm khôi phục các tế bào bị tổn thương hay bị suy yếu. Làm trên 2 đĩa.
Đỗ thêm 15ml môi trường VRB (môi trường VRB dùng nước cất đã hấp khử trùng, đun sôi sau đó cho môi trường vào, không hấp khử trùng môi trường này) để
nguôị 45oC, lắc đều để đặc môi trường. Giai đoạn này nhằm chọn lọc vi khuẩn
Coliforms.
Lật ngược đĩa ủ ở 37oC trong 24 giờ ( hình 3.5)
Đếm tất cả các khuẩn lạc trên cả hai đĩa. Khuẩn lạc đặc trưng của Coliforms có
TSA ở 45oC 5 ml Dịch pha loãng 10-1 1 ml Lắc để yên 1 – 2h VRB ở 45oC 10 ml
Chờ môi trường đặc , lật ngược, đem ủ 37oC trong 24 – 48 giờ Phục hồi VS V Chọn lọc KL coliform
Hình 3.5 Phương pháp đổ đĩa phân tích tổng số Coliforms [11]
Thử nghiệm khẳng định.
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào 5 ống môi trường BGBL, có ống Durham. Ủ 24 giờ, đếm các ống có sinh hơi tính tỉ lệ R ( hình 3.6)
Chọn 5 KL đặc trưng cấy sang 5 ống BGB L
Ủ 37oC/24 – 48h
Kiểm tra khả năng lên men Lactose và
sinh hơi
Tỉ lệ xác nhận
R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã cấy)
Ghi kết quả
Ghi kết quả: Số khuẩn lạc trên cả 2 đĩa. Số ống sinh hơi.
Công thức tính Tổng số Coliforms (cfu/g).
Trong đó C: Tổng cố khuẩn lạc đặc trưng trên tổng số đĩa chọn đếm. N: lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ.
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. f: độ pha loãng tương ứng.
R = (Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL) / (Số khuẩn lạc đã cấy).
Ghi nhận kết quả: Tổng số Coliforms phát hiện trong 25g mẫu
3.5.2 Phương pháp MPN 3.5.2.1 Nguyên tắc
Số lượng Coliforms trong mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp của nhóm vi khuẩn
này có thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1 dãy thập phân (2 nồng độ nối tiếp nhau nhưng khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có 1 ống dẫn khí Durham.