3.4.1.1 Ý nghĩa
Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo
quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản.
3.4.1.2 Nguyên tắc
Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng thành các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trường nuôi cấy. Các khuẩn lạc hình thành trong môi trường sau khi ủ được xem như chúng hình thành từ một tế bào riêng lẻ. Theo yêu cầu của tiêu chuẩn Việt Nam chỉ tiêu này được ủ 30oC trong 72 giờ ± 6 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ ± 6 giờ.
3.4.1.3 Môi trường sử dụng
- Môi trường pha loãng mẫu: Saline Pepton Water ( SPW) hoặc Buffer Pepton Water (BPW).
- Môi trường nuôi cấy : Plate Count Agar (PCA)
3.4.1.5 Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu.
Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1.
Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết.
Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất được độ pha loãng 10-1
Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý để được các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4.
Lật ngược đĩa ủ ở 30oC trong 72 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ
Từ mỗi độ pha loãng hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri đã vô trùng, đổ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 45oC. Mỗi độ pha loãng làm
2 đĩa.
Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25-250 để đếm
Cấy mẫu
Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4, dùng pipetman hút 1ml mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri đã khử trùng. Tiếp tục đỗ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng để nguội khoảng 45oC, lắc đều bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3-5 lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và chờ môi trường đặc lại, lật ngược đĩa ủ 30oC sau 72 giờ hoặc37oC trong 48 giờ (hình 3.2). Chọn tất cả đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 khuẩn lạc để đếm
Hình 3.2 Phương pháp thực hiện đổ đĩa phân tích tổng vi sinh hiếu khí [10]
Đĩa petri vô trùng PCA 45oC 10 -15 ml Dung dịch mẫu đã pha loãng 1 ml
Lắc đều đĩa petri Để nguội Lật n gược đĩa Ủ 30oC/3 ngày Đếm số khuẩn lạc và tính kết quả
Hình 3.3 : Tổng số vi sinh vật hiếu khí [10] - Nếu ở nồng độ pha loãng cao
nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa lớn hơn 250. Ví dụ: ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2,5x107 CFU/ml
- Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa nhỏ hơn 25. Ví dụ: ở nồng độ 10-1 số đếm được nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2,5x102 CFU/ml
- Khuẩn lạc mọc loang tính là 1 khuẩn lạc
Công thức tính kết quả
Đếm tất cả các số khuẩn lạc xuất hiện trên các khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25- 250 để tính kết quả. Mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu được tính theo cong thức sau
Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc ) trong 1g mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường fi: Độ pha loãng tương ứng
Ví dụ: Trong 1 trường hợp phân tích 1g mẫu cụ thể nhận được kết quả như sau:
Kết quả: Nồng độ pha loãng 10-3 10-4 10-5
Đĩa 1 235 26 16 Đĩa 2 246 21 10 (cfu/g) ... 1 1 1 V f ni Vi fi n N A
) / ( 10 . 4 , 2 0001 , 0 . 1 . 1 001 , 0 . 1 . 2 26 246 235 5 g CFU A 3.5 Định lượng tổng số Coliforms 3.5.1 Phương pháp đổ đĩa 3.5.1.1 Ý nghĩa
Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản.
3.5.1.2 Nguyên tắc
Mẫu đã được đồng nhất hoá được cấy 1 lượng nhất định trên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ ở 37 10C trong 24 – 48 giờ. Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho Coliforms còn
chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị pH như Neutral red, crystal.
Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính >
0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật. Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL.
Mật độ Coliforms được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỷ lệ
khẳng định và độ pha loãng trước khi cấy vào đĩa.
Để phát hiện được bộ phận tế bào Coliforms bị tổn thương hay bị giảm sức sống
do quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không tăng trưởng được trong môi trường chọn lọc, trước khi mẫu được cấy vào một môi trường không chọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc.
3.5.1.4 Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu.
Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1.
Đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đếm đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, có đường kính > 5mm
Xác định tỷ lệ R. Tính kết quả. ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ
Chọn 3-5 khuẩn lạc của 2 đĩa cấy vào 5 ống BGBL Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây
Lấy 1ml mẫu trên cho vào 2 đĩa Petri trống đã vô trùng
Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ
Đỗ khoảng 15ml môi trường VRB đã đun tan và làm nguội 45oC Đỗ khoảng 5ml TSA tan chảy và làm nguội đến 45oC, lắc đều
Hình 3.4: Khuẩn lạc Coliforms [8]
Cấy mẫu.
Dùng pipetman hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri trống. Đỗ khoảng 5ml môi trường TSA đã hấp khử trùng để nguôị 45oC, lắc đều để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ. Gai đoạn này nhầm khôi phục các tế bào bị tổn thương hay bị suy yếu. Làm trên 2 đĩa.
Đỗ thêm 15ml môi trường VRB (môi trường VRB dùng nước cất đã hấp khử trùng, đun sôi sau đó cho môi trường vào, không hấp khử trùng môi trường này) để
nguôị 45oC, lắc đều để đặc môi trường. Giai đoạn này nhằm chọn lọc vi khuẩn
Coliforms.
Lật ngược đĩa ủ ở 37oC trong 24 giờ ( hình 3.5)
Đếm tất cả các khuẩn lạc trên cả hai đĩa. Khuẩn lạc đặc trưng của Coliforms có
TSA ở 45oC 5 ml Dịch pha loãng 10-1 1 ml Lắc để yên 1 – 2h VRB ở 45oC 10 ml
Chờ môi trường đặc , lật ngược, đem ủ 37oC trong 24 – 48 giờ Phục hồi VS V Chọn lọc KL coliform
Hình 3.5 Phương pháp đổ đĩa phân tích tổng số Coliforms [11]
Thử nghiệm khẳng định.
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào 5 ống môi trường BGBL, có ống Durham. Ủ 24 giờ, đếm các ống có sinh hơi tính tỉ lệ R ( hình 3.6)
Chọn 5 KL đặc trưng cấy sang 5 ống BGB L
Ủ 37oC/24 – 48h
Kiểm tra khả năng lên men Lactose và
sinh hơi
Tỉ lệ xác nhận
R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã cấy)
Ghi kết quả
Ghi kết quả: Số khuẩn lạc trên cả 2 đĩa. Số ống sinh hơi.
Công thức tính Tổng số Coliforms (cfu/g).
Trong đó C: Tổng cố khuẩn lạc đặc trưng trên tổng số đĩa chọn đếm. N: lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ.
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. f: độ pha loãng tương ứng.
R = (Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL) / (Số khuẩn lạc đã cấy).
Ghi nhận kết quả: Tổng số Coliforms phát hiện trong 25g mẫu
3.5.2 Phương pháp MPN 3.5.2.1 Nguyên tắc
Số lượng Coliforms trong mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp của nhóm vi khuẩn
này có thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1 dãy thập phân (2 nồng độ nối tiếp nhau nhưng khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có 1 ống dẫn khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu.
3.5.2.2 Quy trình thưc hiện
R nVf
N
3.5.2.3 Thuyết minh quy trình
Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu(stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1.
Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng đồng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết.
Tuần tự cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3. Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3
x 3 hay 9 ống nghiệm). Nếu nghi ngờ số lượng Coliforms trong mẫu quá cao, phải sử
dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 48 giờ. Ghi Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây
Lấy 1ml mẫu trên cho vào 3 ống chứa 10ml canh LSB
Ủ 38oC trong 48 giờ, ghi nhận số ống có hơi
Ủ ở 370C 10C trong 48 giờ, ghi nhận các ống sinh hơi (+) Cấy chuyển dịch mẫu từ ống LSB (+) sang các ống chứa canh BGBL
nhận số ống có sinh hơi. Dùng que cấy vòng (khuyên cấy) cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL và ủ ở 370C ± 10C trong 24-48 giờ. Ghi nhận số ống cho kết qủa (+) (có sinh hơi) ứng với mỗi độ pha loãng ( hình 3.7)
Hình 3.7 : Khẳng định Coliform[11]
Ghi nhận kết quả: Tổng số Coliforms
phát hiện trong 25g mẫu ( hình 3.8)
Chọn 5 KL đặc trưng cấy sang 5 ống BGB L
Ủ 37oC/24 – 48h
Kiểm tra khả năng lên men Lactose và
sinh hơi
Tỉ lệ xác nhận
R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã cấy)
Hình 3.8: Kết quả khẳng định
3.6 Xác định Escherichia coli trong thực phẩm
3.6.1 Định tính E.coli trong thực phẩm 3.6.1.1 Ý nghĩa
Là chỉ tiêu đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm trong chế biến, bảo quản, đặc biệt là khả năng nhiễm phân của thực phẩm.
3.6.1.2 Nguyên tắc
Đây là phương pháp dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện
E.coli trong một lượng mẫu xác định.
Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh BGBL, phân lập trên môi trường EMB và khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hoá (nghiệm pháp IMViC).
3.6.1.3 Thuyết mình quy trình
Chuẩn bị mẫu
Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm
Kết luận: phát hiện (hay không phát hiện) E.coli trong 25g mẫu.
Indol (+), MR (+), VP (-), Citratase (-)
Một trong những phản ứng trên sai thì không phải là E.coli
Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa: Canh trypton, MR-VP, Simmon Citrate, để thử nghiệm IMViC
Cân 25g mẫu + 225 môi trường BPW đồng nhất 30 giây
Lấy 1ml mẫu trên vào 10ml môi trường BGBL
Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim, đường kính khoảng 1mm để cấy sang TSA Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ
Ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ
Chọn các ống sinh hơi cấy sang EMB. Mẫu không sinh hơi được xem là âm tính với E.coli
Hình 3.9 : Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB[12]
Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1.
Cấy mẫu
Tăng sinh: Cấy 1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml môi trường tăng sinh BGBL. Ủ trong 24
giờ ở 44oC
Phân lập: Chọn ống nghiệm
có phản ứng dương tính làm đục môi trường và có sinh hơi trong ống durham. Cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa EMB, ủ trong 24 giờ ở 37oC. Nhận dạng khuẩn lạc
đặc trưng E.coli: Khuẩn lạc tròn,
dẹp,ánh kim tím, đường kính khoảng 0.5mm ( hình 3.9). Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA,
tăng sinh không chọn lọc.
Thử nghiệm khẳng định
Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm IMViC. Thực hiện như sau.
Thử nghiệm khả năng sinh indol: Cấy vi sinh vật qua môi trường canh Trypton ủ
khoảng 24 giờ ở 37oC. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s. Phản ứng dương (+) tính khi trên bề mặt có vòng đỏ cánh sen xuất hiện, âm tính (-) khi không có vòng đỏ xuất hiện.
Thử nghiệm methyl red: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose
photphate ủ trong khoảng 24 giờ ở 37oC . Thêm vào vài giọt thuốc thử methyl red được pha theo tỉ lệ 0,1g trong 300ml cồn và cho nước vào để đạt thể tích 500ml. Phản ứng
Hình 3.10: Nghiệm pháp IMViC [12] A: Indol (+) , B: Methyl red(+)
C: Voges Prokauer (-), D: khả năng sinh citrate (-)
dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ. Phản ứng âm tính khi môi trường giữ nguyên màu vàng.
Thử nghiệm Voges-Proskauer: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose
photphate ủ trong khoảng 2-5 ngày. thêm vào vài giọt dung dịch KOH 40 % sau đó thêm dung dịch 1-αnapthol 5% tỷ lệ 1:3. Quan sát phản ứng trong khoảng 5 phút. Phản ứng Voges-Proskauer dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ hay hồng sáng, phản ứng âm tính khi không có sự chuyển màu.
Thử nghiệm citrate : Cấy vi sinh vật vào môi trường thạch nghiên Simmon
Citrate có màu xanh lục, ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Phản ứng dương (+) tính khi môi trường đổ sang màu xanh dương, âm tính (-) khi môi trường không đổi màu.
Kết quả thử nghiệm phát hiện E.coli (bảng 3.1)
Bảng 3.1: Ghi nhận kết quả thử nghiệm sinh hoá TT Thử nghiệm sinh hoá Kết quả
1 Indol +
2 Methyl red +
3 Voges Prokauer -
4 Khả năng sử dung citrate -
Ghi kết quả
Phát hiện E.coli khi thử
nghiệm IMViC có kết quả (+ + - - ) ( hình 3.10)
Không phát hiện E.coli
khi thử nghiệm IMViC không có kết quả (+ + - - )
Phát hiện hay không
3.6.2 Định lượng E.coli trong thực phẩm bằng phương pháp dếm khuẩn lạc 3.6.2.1 Nguyên tắc
Mẫu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn