1.3.1 Phƣơng pháp tách và làm giàu
Để thực hiện một quy trình phân tích tổng thể bất kì một chất hoặc cấu tử nào, đều phải thực hiện các bƣớc sau: xác định vấn đề/đối tƣợng phân tích; lựa chọn phƣơng pháp phân tích; chọn mẫu và xử lý mẫu; tách và làm giàu; đo định lƣợng chất phân tích; đánh giá kết quả.Đối với nhóm chất phenicol, do tính chất hầu nhƣ tan rất yếu trong nƣớc và tan tốt trong dung môi hữu cơ, đồng thời trong thực phẩm thƣờng tồn tại ở dạng vết vì vậy chúng thƣờng đƣợc tách, làm giàu và định lƣợng riêng.
- Tách và làm giàu sơ bộ [15]:
Trƣớc đây, các phƣơng pháp tách và làm giàu sơ bộ thƣờng đƣợc sử dụng là: chiết lỏng - lỏng, chiết soxhlet, cất lôi cuốn hơi nƣớc, chiết siêu tới hạn. Ngày nay ngƣời ta còn sử dụng một số phƣơng pháp tách chiết hiện đại hơn nhƣ phƣơng pháp chiết bằng lò vi sóng hay phƣơng pháp chiết siêu âm. Các phƣơng pháp này chỉ sử dụng một lƣợng nhỏ các dung môi và tiết kiệm thời gian.
- Làm sạch: đây là giai đoạn loại bỏ các chất bẩn và các cấu tử gây cản trở phép xác định. Các vật liệu rắn dùng cho giai đoạn làm sạch thƣờng là: ôxit nhôm, magiê silicat nhân tạo (florisil), silica-gel, silicagel ankyl hóa, polime. Các vật liệu làm sạch này có khả năng loại trừ ảnh hƣởng của hợp chất béo, các hydrocacbon thơm, các hợp chất cơ phốt pho và các hợp chất hữu cơ chứa nitơ… Đặc biệt hơn, phƣơng pháp làm sạch mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn (solid phase extraction - SPE) hoặc vi chiết pha rắn (solid phase microextraction - SPME) hiện nay đang đƣợc sử dụng rộng rãi để chiết và làm giàu nhóm chất kháng sinh trong các đối tƣợng môi trƣờng và trong cơ thể sinh vật. Các loại cột chiết pha rắn thƣờng dùng là: cyano, diol, R- NH2, C18, C8, silicagel,…
1.3.2. Phƣơng pháp phân tích
Phân tích tồn dƣ kháng sinh từ cách đây khá lâu đã là vấn đề đƣợc rất nhiều nhà khoa học quan tâm vì nó liên quan trực tiếp đến sức khỏe con ngƣời. Đặc biệt hơn nó là đối tƣợng đa ngành bao gồm của cả khối y dƣợc, sinh học và hóa học.
1.3.2.1 Phƣơng pháp sinh hóa
Trong phân tích dƣ lƣợng kháng sinh, phƣơng pháp vi sinh vật (VSV) đã và đang đƣợc sử dụng rộng rãi và đóng một vai trò quan trọng trong kiểm soát dƣ lƣợng kháng sinh trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật [28]. Nhiều phƣơng pháp VSV đã đƣợc nghiên cứu, thích ứng và ứng dụng trong chiến lƣợc kiểm soát ở các nƣớc phát triển [21] nhƣ phƣơng pháp bốn đĩa của Châu Âu (Four Plate Test) [19], test thận của Bỉ (Belgian Kidney Test) hay test một đĩa (One Plate Test) [24], phƣơng pháp năm đĩa mới của Hà Lan (NAT: Nouws antibiotic test) hay STAR (Screening Test for Antibiotic Residues) protocol của Pháp [28]… Trong bối cảnh cần kiểm soát và phân tích một số lƣợng mẫu lớn thì những phƣơng pháp sàng lọc này đã đƣợc khuyến cáo áp dụng trƣớc khi dùng các phƣơng pháp đặc hiệu để định lƣợng.
Là nhóm chất có hoạt tính sinh học, do đó dựa trên đặc tính này phƣơng pháp hóa sinh bán định lƣợng ELISA đã đƣợc ứng dụng phổ biến trong hầu hết các
phòng thí nghiệm trên thế giới cho phân tích kháng sinh đặc biệt là Chloramphenicol[6]. Về nguyên tắc: Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Tuy nhiên ELISA chỉ có tính chất bán định lƣợng, các mẫu dƣơng tính và dƣơng tính giả sau đó cần kiểm tra lại bằng các kỹ thuật sắc ký. Tại Việt Nam, phòng thí nghiệm NAFIQAVED4 – thành phố Hồ chí Minh sử dụng phƣơng pháp này kết hợp với LC/MS để xác định Chloramphenicol trong các mẫu thủy sản với giới hạn phát hiện 0,1ppb.
Tuy nhiên, đối với yêu cầu kiểm soát và định lƣợng và đặc biệt với những kháng sinh đã bị cấm sử dụng thì áp dụng các phƣơng pháp hóa học lại tỏ ra ƣu việt và cần thiết. Ngày nay với sự phát triển các kỹ thuật phân tích công cụ việc định lƣợng chất phân tích đã trở nên dễ dàng hơn với độ nhạy và khả năng phát hiện cũng nhƣ khả năng định lƣợng ngày càng tốt. Trong phân tích ngƣời ta đã và đang tiến dần tới những mức định lƣợng ở cấp lƣợng vết, siêu vết và hơn nữa là cấp độ phân tử. Đối với việc định lƣợng nhóm Phenicol, trên Thế giới đã có nhiều nghiên cứu với các phƣơng pháp hiện đại từ quang phổ hấp thụ, sắc ký lỏng hiệu năng cao, điện di mao quản…
1.3.2.2 Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử
Các tác giả của khoa dƣợc học, trƣờng Đại học Benin, Nigeria đã tiến hành phản ứng khử Chloramphenicol trong một hỗn hợp Axit axetic và nƣớc bằng Titan (III) Clorua tại nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sản phẩm của phản ứng cho kết hợp với p-dimetylaminobenzandehit và đƣợc gia nhiệt trong vòng 20 phút. Sau hai bƣớc phản ứng thu đƣợc sản phẩm cuối cùng là hợp chất màu vàng có khả năng hấp thụ
mạnh tại bƣớc sóng 440nm. Độ thu hồi của phƣơng pháp là trên 90%, hệ số biến thiên từ 0,61 đến 2,17% tại khoảng nồng độ từ 1,05 đến 17,8μg/ml. Đây là một phƣơng pháp nhanh, hiệu quả và chi phí khá rẻ, song giới hạn phát hiện của phƣơng pháp đạt đƣợc chƣa cao 1,05 μg/ml. Kết quả phát hiện và định lƣợng của phƣơng pháp đƣợc các tác giả so sánh phƣơng pháp phân tích vi sinh vật cho thấy không có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê. Công trình nghiên cứu này đƣợc công bố năm 2003[20].
1.3.2.3 Phƣơng pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Từ năm 1978, hai tác giả Robert L.thies và Lawrence J.Fischer đã tiến hành xác định Chloramphenicol trong nền mẫu sinh học (nƣớc tiểu, dịch tủy não, huyết thanh) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Chất phân tích từ các nền mẫu đƣợc chiết với Dietyl ete, sau khi li tâm, thu lớp hữu cơ phía trên và làm bay hơi bằng dòng N2 ở nhiệt độ phòng. Sau đó dùng Metanol để hòa cắn và đƣa vào phân tích trên hệ thống HPLC. Phƣơng pháp sử dụng cột tách pha đảo, detector UV tại bƣớc sóng 278m, dung môi rửa giải là Metanol và nƣớc với tỉ lệ thể tích lần lƣợt là 30/70. Quá trình rửa giải kéo dài trong khoảng 5.5 phút. Phƣơng pháp có thể xác định đƣợc 1μg CAP trong 1ml dung dịch mẫu. Hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp với các đối tƣợng mẫu khoảng 80% [31].
Gần đây nhất (10/2011), một công trình nghiên cứu của hai tác giả Fuad Al- Rimawi và Maher Kharoaf đã phân tích Chloramphenicol và dẫn chất liên quan 2- Amino-1-(4-nitrophenyl)propane -1-3-diol trong thuốc bằng sắc ký lỏng pha đảo và detector UV-VIS. Nghiên cứu tiến hành phân tích với detector UV-VIS tại bƣớc sóng 278nm, sử dụng cột pha đảo C18, chạy chế độ đẳng dòng 2mL/phút, và pha động là hỗn hợp Natri pentasunfonat (0,012M), Acetonitril, Axitaxetic băng với tỉ lệ thể tích là 85:15:1. Phƣơng pháp xây dựng nồng độ hai chất trong khoảng tuyến tính từ 0,04-0,16mg/mL, đạt độ thu hồi là 100% với độ lệch chuẩn 0,1%. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng đối với CAP lần lƣợt là 0,005% và 0,015%. Đây là phƣơng pháp có độ chính xác, độ nhạy và độ thu hồi rất tốt, song nó chỉ đƣợc ứng dụng trên mẫu dƣợc phẩm có Chloramphenicol với hàm lƣợng tƣơng đối cao [22].
1.3.2.4 Phƣơng pháp sắc ký khối phổ
Nhìn chung các công trình nghiên cứu trƣớc đó với các phƣơng pháp phân tích sinh hóa, quang phổ, sắc ký lỏng, điện di mao quản đều cho ngƣỡng phát hiện cỡ ppm. Nhƣng khi khối phổ ra đời, ban đầu chỉ đƣợc dùng chủ yếu cho xác định cấu trúc các chất, nhƣng khi đƣợc ghép nối với sắc ký lỏng hiệu năng cao nó đã trở thành một hệ thống có ƣu thế vƣợt trội trong phân tích các chất với khả năng phát hiện ở nồng độ rất thấp.
Trong những năm gần đây, kỹ thuật sắc ký khối phổ đang đƣợc nghiên cứu và áp dụng khá rộng rãi đối với nhóm kháng sinh Phenicol, nhất là khi Chloramphenicol đang dần đƣợc thay thế bằng những kháng sinh thế hệ mới của nó thì việc phân tích và định lƣợng không chỉ dừng lại ở phân tích riêng CAP mà còn mở rộng sang cả nhóm kháng sinh này.
Trên tạp chí về sắc ký công bố năm 2009, tác giả Janzhong Shen cùng với cộng sự đã xác định đồng thời CAP, TAP, FF và FF amin trong cơ và gan gia cầm bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ với quá trình ion hóa hóa học âm (GC-NCI/MS). Phƣơng pháp sử dụng nội chuẩn CAP-d5, chạy MS với chế độ SIM và đạt đƣợc độ thu hồi từ 78,5 đến 105,5%, độ lệch chuẩn liên quan (RSD) <17%. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 0,1ng/g mẫu đối với CAP, 0,5ng/g mẫu đối với các chất còn lại [25]
Trên tạp chí phân tích thế giới, các tác giả Rebecca S. Nicolich và cộng sự đã nghiên cứu thành công và áp dụng phƣơng pháp phân tích đó để kiểm soát CAP trong các mẫu sữa tại thị trƣờng Brazil bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ. Phƣơng pháp có độ thu hồi trên 95% và giới hạn phát hiện là 0,09ng/mL [30].
Cục quản lý dƣợc và thực phẩm của Mỹ cũng đƣa ra một số quy trình tham khảo để phân tích và kiểm soát CAP trong một số mẫu thủy sản bằng kỹ thuật LC- MS/MS vơí khả năng phát hiện 0,08ppb [18, 23]
Trong điều kiện của nƣớc ta, do chiến lƣợc kiểm soát dƣ lƣợng các chất tồn dƣ nói chung và kháng sinh nói riêng chƣa thực sự rõ ràng, khi triển khai gặp rất nhiều khó khăn. Các yêu cầu về nghiên cứu phƣơng pháp để lựa chọn đƣợc những điều kiện phân tích và có khả năng ứng dụng vẫn đang đặt ra đặc biệt là khi chất phân tích cần kiểm soát ở lƣợng vết cũng nhƣ cần phải sử dụng thiết bị phân tích yêu cầu kĩ thuật cao nhƣ sắc ký khối phổ.
Phƣơng pháp HPLC phát triển vững chắc trong đầu những năm 70, khi các vật liệu hiệu quả cao đƣợc sản xuất cùng với các tiến bộ về thiết bị cho phép thực hiện đầy đủ năng lực của các loại vật liệu này. Tiếp sau đó kĩ thuật ghép nối HPLC với khối phổ đƣợc ra đời, ngày càng phát triển mạnh hơn và thể hiện tính ƣu việt của nó trong phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau. Nguyên lý hoạt động của nó là các cấu tử đƣợc tách khỏi cột sắc ký sẽ lần lƣợt đƣợc đƣa vào nguồn ion của máy khối phổ. Tại đó, chúng đƣợc phân mảnh và đƣợc tách khối nhờ một từ trƣờng rồi đi vào bộ nhân quang để chuyển hóa thành tín hiệu điện. Ứng với mỗi một pic trên sắc ký đồ sẽ nhận đƣợc một khối phổ đồ riêng biệt và hoàn chỉnh [8]
Kỹ thuật ghép nối LC-MS này đƣợc phát triển rất nhanh và cho đến nay đã trở nên khá phổ biến với nhiều ƣu điểm đặc trƣng đó là: sử dụng các hợp chất đồng vị đánh dấu làm chất chuẩn để làm tăng độ chính xác của phép phân tích, có thể xác định thành phần nguyên tố của hợp chất nếu sử dụng thiết bị có độ phân giải cao và có thể phân tách đƣợc các pic sắc ký không phân tách trên cơ sở sự khác nhau về phổ khối của chúng, nghiên cứu đƣợc các hợp chất không bền, tách và nhận biết đồng thời hỗn hợp nhiều cấu tử, lƣợng mẫu nhỏ. Ngoài ra, thiết bị sắc ký lỏng còn có thể ghép nối với nhiều thiết bị phổ khác nhau nhƣ: cộng hƣởng từ hạt nhân, phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier, quang phổ phát xạ và hấp thụ nguyên tử…[15, 17]
Hình 1.1 Sơ đồ thiết bị lỏng khối phổ (LC/MS)
1.3.2.4.1 Nguyên tắc hoạt động của HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phƣơng pháp có đặc thù riêng, đó là sắc ký lỏng pha liên kết, sắc ký phân bố lỏng-lỏng và sắc ký trao đổi ion lỏng – rắn, sắc ký hấp phụ lỏng – rắn (trong đó một dạng đặc biệt là sắc ký ái lực) v.v. [11]
Trong LC/MS, phần sắc ký lỏng đóng vai trò tách chất để đƣa vào MS nhận biết và định lƣợng. Do đó hai yếu tố quan trọng để thực hiện vai trò của HPLC cần nói tới ở đây là lựa chọn pha tĩnh (cột nhồi) và pha động cho quá trình chạy chất phân tích. Trong luận văn này chúng tôi chỉ xin đề cập tới hai yếu tố đó trong sắc ký lỏng pha liên kết – đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi do những tính chất ƣu việt của nó. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.3.2.4.2 Pha tĩnh trong HPLC [11]
Sắc ký pha thƣờng: Khi dùng trực tiếp silicagen làm pha tĩnh ta có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực. Pha động là các dung môi không phân cực, thí dụ n-hexan, toluene… nên gọi là sắc ký pha thƣờng hay còn gọi là sắc ký trực tiếp (silicagen trần). Khi silicagen đƣợc gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực nhƣ các aminopropyl: -(CH2)3NH2, cyanopropyl: - (CH2)3CN, propyldiol: -(CH2)3-O-CH2-CH(OH)-CH2OH, nhƣ vậy pha tĩnh phân
cực mang những tính chất khác nhau, còn pha động không phân cực, đây cũng là sắc ký pha thƣờng.
Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh là silicagen có gắn gốc ankyl mạch dài, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37 cho nên không phân cực, còn pha động phân cực. Nó đƣợc sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng, từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực.
Tạp chí “Analytical Chemistry” đã có tổng kết khá lý thú về các công trình sắc ký lỏng hiệu năng cao đã đƣợc công bố: khoảng 74% các công trình thuộc về phƣơng pháp sắc ký pha liên kết, trong đó 60% là sắc ký pha đảo, phần còn lại là của sắc ký pha thƣờng.
1.3.2.4.3 Pha động trong HPLC [11]
Trong sắc ký pha thƣờng, pha động là các dung môi không phân cực nhƣ benzene, n-hexan, toluene… còn trong sắc ký pha đảo, pha động là các dung môi phân cực có thể là nƣớc, methanol, axetonitril… Tuy nhiên, ngƣời ta thƣờng dùng hỗn hợp hai hay ba dung môi để có một pha động có độ phân cực phù hợp với phép phân tích. Tách các hỗn hợp mẫu phức tạp ngƣời ta phải dùng pha động có thành phần là hỗn hợp các dung môi. Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trƣờng hợp này ngƣời ta gọi là rửa giải gradient nồng độ
Pha động phải thỏa mãn các điều kiện sau: - Trơ với pha tĩnh
- Hòa tan đƣợc mẫu phân tích
- Bền vững trong thời gian chạy sắc ký - Có độ tinh khiết cao
- Phù hợp với detector - Không quá đắt.
Một ƣu điểm của sắc ký pha đảo là sử dụng hệ pha động phân cực, thƣờng là nƣớc và một dung môi hữu cơ khác nhƣ methanol, axetonitril… Nhƣ vậy có thể đáp
ứng đƣợc mục đích về kinh tế, hơn nữa do tính chất đa dạng của pha tĩnh có thể tách đƣợc nhiều loại mẫu khác nhau.
1.3.2.4.5 Detector trong HPLC [11, 15]
Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phƣơng pháp. Tuỳ thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp.
Detector quang phổ hấp thụ phân tử: áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS).
Detector huỳnh quang RF: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang. Đối với những chất không có khả năng nhƣ vậy, cần phải dẫn xuất hoá chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.
Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: các ion kim loại chuyển tiếp....