Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lƣợng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lƣợng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng nhƣ loại bỏ electron, proton hóa,... Các ion tạo thành này đƣợc tách theo tỉ số m/z, từ đó có thể cho thông tin về khối lƣợng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất.
Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và detector. Trƣớc hết, các mẫu đƣợc ion hóa trong nguồn ion, sau đó đƣa
vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín hiệu thu đƣợc sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lƣu trữ.
*/ Nguồn ion
Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ đƣợc dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và đƣợc ion hóa. Một số kĩ thuật ion hóa đƣợc sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ nhƣ: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric-pressure chemical ionization – APCI), ion hóa bắn phá nguyên tử nhanh (fast-atom bombardment – FAB). Dƣới đây là phƣơng pháp ion hóa đƣợc sử dụng trên thiết bị khối phổ mà chúng tôi nghiên cứu:
Ion hóa phun điện tử – ESI
Kĩ thuật này chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí. Dung dịch mẫu đƣợc dẫn vào vùng có trƣờng điện từ mạnh đƣợc duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV. Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và đƣợc hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân tích khối phổ. Các giọt nhỏ trƣớc khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ đƣợc kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung môi. Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dƣơng và ion âm.
Đây là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao. Kĩ thuật này ứng dụng phân tích các chất không phân cực nhƣ: protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit, polyetilen glycocol,... và các chất phân cực có khối lƣợng phân tử nhỏ.
*/ Bộ phận phân tích khối lƣợng
a) Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)
Tứ cực đƣợc cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua. Một trƣờng điện từ đƣợc tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF). Các tứ cực đƣợc đóng vai trò nhƣ một bộ lọc khối. Khi một trƣờng điện từ đƣợc áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trƣờng RF. Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua đƣợc bộ lọc này.
b) Bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)
Loại thiết bị này bao gồm một điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện cực bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dƣới. Trái với loại thiết bị tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đƣờng cong ổn định đƣợc bẫy lại cho đến khi một điện áp RF đƣợc đặt trên điện cực vòng. Các ion khác nhau m/z sau đó trở nên không ổn định và sẽ có hƣớng đi về phía detector. Do điện áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu đƣợc một phổ khối lƣợng đầy đủ.
Các ion tồn tại trong bẫy có thể đƣợc chọn riêng và phân tích theo sự khác nhau về m/z, đồng thời có thể chọn riêng và thực hiện quá trình bắn phá để thu đƣợc các mảnh ion con, từ đó thực hiện phân tích theo m/z của ion con (khối phổ 2 lần). Về nguyên tắc các ion có thể tồn tại trong bẫy thời gian đủ lâu có thể thực hiện đến MS n lần, tuy nhiên trong thực tế thƣờng chỉ có khả năng thực hiện đến khối phổ 3 lần.
c) Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser)
Phân tích thời gian bay dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng một năng lƣợng. Do các ion có cùng năng lƣợng nhƣng lại khác nhau về khối lƣợng
nên thời gian đi tới detector sẽ khác nhau. Các ion nhỏ hơn sẽ đi tới detector nhanh hơn do có vận tốc lớn hơn còn các ion lớn hơn sẽ đi chậm hơn, do vậy, thiết bị này đƣợc gọi là thiết bị phân tích thời gian bay do tỉ số m/z đƣợc xác định bởi thời gian bay của các ion. Thời gian bay của một ion tới detector phụ thuộc vào khối lƣợng, điện tích và năng lƣợng động học của các ion. Độ phân giải của bộ phân tích thời gian bay thấp nhƣng nó có ƣu điểm là khối lƣợng ion có thể phân tích không bị hạn chế.
*/ Bộ phận phát hiện
Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối lƣợng, các ion đƣợc đƣa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tƣơng ứng từ các electron thứ cấp đã đƣợc khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang.
Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron. Các electron thứ cấp sau đó đƣợc dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron.
Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống nhƣ thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng các electron. Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phôtpho và giải phóng ra các photon. Các photon này đƣợc phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động nhƣ thiết bị nhân electron. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là các ống nhân quang đƣợc đặt trong chân không nên loại bỏ đƣợc các khả năng nhiễm bẩn.
Chƣơng 2 : NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu
2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng mà chúng tôi thực hiện phân tích trong luận văn này là các mẫu thịt bao gồm cá, tôm, lợn và gà. Đây là những loại động vật phổ biến và chiếm phần lớn trong việc cung cấp thịt làm thực phẩm hàng ngày cho ngƣời tiêu dùng.
Nhƣ ở trên đã nói tới các giá trị giới hạn tồn dƣ cho phép lớn nhất đƣợc quy định cụ thể và có sự khác biệt trên các cơ quan của động vật (trong thận, gan, cơ). Trong luận văn này chúng tôi tiến hành trên đối tƣợng cụ thể là cơ động vật. Song MRL là một yếu tố phụ thuộc cả vào tập quán, điều kiện sống của các khu vực khác nhau mà có những quy định cụ thể khác nhau. Chẳng hạn khi xuất khẩu sang các nƣớc EU, Mỹ hay Nhật Bản … thì chúng ta chỉ xuất khẩu phần cơ của động vật, nhƣng ở thị trƣờng trong nƣớc và tập quán ăn uống lại khác nên các đối tƣợng mẫu trên khi xử lý cũng có những điểm khác nhau.
Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phƣơng pháp xác định đồng thời hai chất trong nhóm Phenicol (Chloramphenicol và Florfenicol) trong các đối tƣợng nêu trên bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS.
2.1.2 Nội dung nghiên cứu
Khảo sát và xây dựng qui trình tối ƣu phân tích đồng thời hai hợp chất trong nhóm phenicol trên nền mẫu cá trên thiết bị LC/MS/MS. Bao gồm:
Khảo sát phƣơng pháp
- Khảo sát các điều kiện tách chiết mẫu - Khảo sát các điều kiện chạy máy Thẩm định phƣơng pháp
- Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lƣợng LOQ - Khoảng tuyến tính
- Độ chụm (độ lặp lại)
- Độ đúng (độ chệch, độ thu hồi)
Ứng dụng quy trình phân tích mới để khảo sát tồn dƣ kháng sinh nhóm Phenicol trong một số mẫu thịt thu thập trên địa bàn Hà Nội.
2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ 2.2.1.1. Thiết bị
Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem: bộ phận bơm dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt và detector MS.
Cột sắc ký C18 của Water (150mm × 4,6mm × 5μm). Máy lắc vortex.
Máy đồng nhất mẫu. Máy li tâm MIKRO 22R.
Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg). Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g).
Máy cất quay chân không Eyela.
2.2.1.2. Dụng cụ
Pipet: 1, 2, 5, 10, 20ml.
Bình định mức: 5, 10, 500, 1000ml
Ống li tâm 50ml
Cột chiết pha rắn C18 và Floresil
Vial loại 1,8ml.
Pipet pasteur.
Ống đong, phễu, giấy lọc.
Pietman loại 200µl; 1000µl và đầu côn.
2.2.2. Dung môi, hóa chất
Tất cả các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích Chất Chuẩn nhóm Phenicol gồm có: Chloramphenicol; Florfenicol. Etylaxetat Amoniaxetat n-Hexan Metanol Axitaxetic Nƣớc cất hai lần Axeton Axetonitril
*/ Chuẩn bị dung dịch chất chuẩn
Dung dịch chất chuẩn gốc : CAP 214ppm và FF 100ppm (hai chất chuẩn đã đƣợc pha và bảo quản ở 0 – 50C tại phòng thí nghiệm từ trƣớc).
Dung dịch chất chuẩn trung gian:
- Dung dịch CAP 10ppm và 1ppm. Cách pha: Lấy chính xác 234µl dung dịch chuẩn gốc CAP 214ppm cho vào bình định mức 5ml, định mức tới vạch bằng Metanol thu đƣợc dung dịch CAP 10ppm. Lấy chính xác 500µl dung dịch CAP 1ppm cho vào bình định mức 5ml, định mức tới vạch bằng Metanol thu đƣợc dung dịch CAP 1ppm.
- Dung dịch FF 1ppm : Lấy chính xác 50μl dung dịch chuẩn gốc FF 100ppm cho vào bình định mức 5ml, định mức tới vạch bằng Metanol thu đƣợc dung dịch FF 1ppm.
Dung dịch CAP và FF 1ppm đƣợc bảo quản ở 0 – 8oC trong tủ lạnh.
Dung dịch chất chuẩn làm việc: Hỗn hợp dung dịch CAP và FF 10ppb. Lấy chính xác 100μl dung dịch CAP 1ppm và 100μl dung dịch FF 1ppm cho vào bình định mức 10ml, định mức tới vạch bằng Metanol thu đƣợc hỗn hợp dung dịch CAP và FF 10ppb.
*/ Chuẩn bị các dung dịch cho khảo sát phƣơng pháp:
- Axít Axetic 0,1%: Hút 1ml Axít axetic băng cho vào bình định mức 1000ml (đã có sẵn một ít nƣớc), định mức tới vạch bằng nƣớc cất hai lần (đã lọc qua bộ lọc dung môi chạy sắc ký), rung siêu âm, thu đƣợc dung dịch axit Axetic 0,1%
- Dung dịch Amoniaxetat 4%: Cân 20,83g amoniaxetat tinh thể hòa tan với 500 ml nƣớc thu đƣợc dung dịch Amoniaxetat 4%.
-Dung dịch Amoniaxetat 0,1%: Cân 1.0010 g Amoniaxetat tin thể hòa tan trong bình định mức 1000ml bằng nƣớc, định mức tới vạch.
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Lựa chọn nền mẫu cho khảo sát phƣơng pháp và xử lý mẫu sơ bộ
Đối tƣợng phân tích trong luận văn mà chúng tôi nghiên cứu là các mẫu thịt từ một số loại động vật khác nhau. Do đó để đảm bảo tính chính xác và áp dụng đƣợc phƣơng pháp nghiên cứu cần lựa chọn nền mẫu có tính đại diện cao cho các đối tƣợng đƣợc áp dụng để khảo sát.
Lựa chọn nền mẫu phụ thuộc vào thành phần chính của các đối tƣợng nghiên cứu, dựa trên một số tiêu chí của ngành và tham khảo quyết định N° 2002/657/CE do EU ban hành.
Các mẫu cá dạng nguyên con hoặc cắt khúc khi đem về phòng thí nghiệm sẽ đƣợc loại vẩy, xƣơng, lọc lấy phần cơ thịt rồi đem đồng nhất.
Mẫu tôm thu thập ở dạng nguyên con, chúng tôi xử lý ở hai dạng: mẫu để nguyên con và mẫu chỉ thu phần thịt tôm, sau đó đem đồng nhất.
Các mẫu thịt lợn, gà đƣợc loại phần da, xƣơng, lớp mỡ bên ngoài sau đó đem đồng nhất.
2.3.2 Phƣơng pháp khảo sát các điều kiện tách chiết mẫu
a/ Tách chiết và làm giàu sơ bộ
Kết hợp với tính chất hóa lý của chất cần phân tích và nền mẫu, dung môi tách chiết ban đầu cho khảo sát đƣợc chúng tôi lựa chọn theo tiêu chí cơ bản sau: dựa trên độ phân cực, khả năng tƣơng tác với chất phân tích (tính chọn lọc) (xem xét tới cả khả năng ảnh hƣởng có gây thay đổi cấu trúc chất phân tích không), nhiệt độ bay hơi, hàm lƣợng nƣớc trong dung môi, tính độc trong đó độ phân cực đƣợc chúng tôi ƣu tiên hàng đầu
Bảng sau đây đƣa ra những thông tin cần thiết về một số loại dung môi hay đƣợc sử dụng trong sắc ký lỏng [15]:
Bảng 2.1 Đặc điểm lý hóa của một số loại dung môi Dung môi % Nƣớc (V/V) Vùng UV tới hạn Nhiệt độ sôi nhớt Độ o trên silic o trên oxit nhôm P (độ phân cực) Isooctan n-heptan n-hexan Xyclohexan Cacbontetracloua Isopropylete Clorofom 1,2 dicloetan Tetrahydrofuran Etyl axetat Trietylamin Axetonitril Dioxan Tert-butanol n-butanol Isopropanol Etanol Metanol Nƣớc 0,0005 0,0005 - 0,0005 - 0,008 0,006 0,007 0,13 0,06 - 0,22 0,14 - - 0,7 0,5 5,2 100 197nm 195 190 200 265 220 245 228 212 256 - 190 215 - 210 205 210 205 99 98 69 81 77 110 61 83 66 77 89 82 101 82 118 82 78 65 0,47 0,4 0,4 0,9 0,9 0,55 0,53 0,78 0,46 0,43 0,36 0,34 1,2 3,6 2,6 1,9 1,08 0,54 - 0 0 - 0,11 0,32 0,26 0,34 0,53 0,48 - 0,52 0,51 - - 0,60 - 0,70 - 0,01 0,01 0,01 0,04 0,17 0,28 0,36 0,44 0,51 0,60 0,36 0,55 0,61 0,70 0,80 0,82 0,88 0,95 >0,95 - 0,2 0,1 -0,2 1,6 1,83 4,1 - 4,28 4,24 2,19 5,8 5,27 0,03 3,9 4,0 4,40 5,1 10,2
Với khả năng tan tốt của nhóm phenicol trong các dung môi có độ phân cực trung bình và theo tiêu chí chọn lọc với chất phân tích trong nền mẫu sinh học, chúng tôi chọn ra 3 dung môi cho khảo sát là Axetonitril, Axeton, Etylaxetat.
Sau khi mẫu đã đƣợc đồng nhất và lựa chọn các dung môi khảo sát, chúng tôi tiến hành nhƣ sau: Cân 10g mẫu cho vào ống ly tâm 50ml, thêm dung dịch chuẩn, sau đó thêm 20ml dung môi, vortex và lắc trong khoảng 5 phút, rồi đem ly tâm ở 6000v/phút trong 5 phút, gạn thu dịch chiết sang một ống ly tâm khác. Chiết lặp lại một lần nữa với phần bã với 10ml dung môi. Gộp dịch chiết hai lần cho vào bình cô quay 100ml, cô quay tới cạn ở 400C. Sau đó hòa cắn bằng 12 ml dung dịch NH4OOCCH3 4%
b/ Làm sạch và làm giàu dịch chiết
Dịch chiết từ nền mẫu sinh học thƣờng chứa nhiều tạp chất nhƣ lipit, các axít béo, amin, rƣợu… Do đó chúng tôi lựa chọn chiết pha rắn để loại bỏ các tạp chất này cũng nhƣ để làm sạch dịch chiết. Tuy nhiên, các đối tƣợng mẫu khảo sát thƣờng có hàm lƣợng lipit sau bƣớc làm giàu sơ bộ khá cao, nên trƣớc khi nạp mẫu qua cột chiết pha rắn, n-hexan đƣợc dùng để chiết bỏ lipit, chúng tôi sử dụng 10ml n – hexan, chiết lặp hai lần với dung dịch thu đƣợc ở trên.
Quá trình chiết pha rắn, chúng tôi khảo sát trên hai loại cột chiết C18 và cột Floresil với dung môi hoạt hóa và rửa giải là H2O và Metanol.
Tối ƣu hóa thể tích rửa giải chúng tôi sử dụng Metanol làm dung môi rửa giải và khảo sát ở bốn mức thể tích là 1ml, 2ml, 3ml, 4ml.
2.3.3 Tối ƣu hóa điều kiện chạy sắc ký 2.3.3.1 Điều kiện phân tích trên LC-MS 2.3.3.1 Điều kiện phân tích trên LC-MS
Việc phân tích định tính và định lƣợng CAP và FF đƣợc tiến hành trên máy LC-MS/MS ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem
Để tìm các điều kiện phân tích tối ƣu trên thiết bị, chúng tôi tiến hành khảo sát với:
MS: Khảo sát các điều kiện bắn phá với ion mẹ và ion con (Năng lƣợng, thế bắn phá, chế độ bắn phá…)
HPLC: Khảo sát loại pha động, gradient, tốc độ dòng… Ở đây loại cột và nhiệt độ buồng cột là không thay đổi (cột tách đƣợc giữ ở nhiệt độ phòng, bộ phận bơm mẫu tự động ở 100C)