Trong phƣơng pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hƣởng tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hƣởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích. Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion âm, quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất nhƣ acid acetic, acid focmic. Dùng dung dịch chuẩn hỗn hợp CAP và FF 2ppb để khảo sát thành phần pha động, các điều kiện chạy máy đƣợc cố định nhƣ sau:
- Cột Symestry Shield Water C18 và tiền cột. - Detector: khối phổ.
- Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút.
- Pha động: kênh B lần lƣợt là methanol, Axetonitrin, kênh A lần lƣợt là axit acetic 0,1%, CH3COONH4 0,1% trong nƣớc, Nƣớc.
- Tỉ lệ kênh A:kênh B = 10:90 (v/v)
Kết quả khảo sát ở dạng tín hiệu pic cho bởi các sắc đồ sau đây:
Hình 3.1 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha độngkhảo sát MeOH – CH3COOH 0,1%
Hình 3.2 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát
MeOH – H2O
Hình 3.3 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát MeOH
Hình 3.4 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát
ACN – H20
Hình 3.5 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát
ACN – CH3COOH 0,1%
Hình 3.6 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát
Chúng tôi tổng kết trong bảng sau:
Bảng 3.5 Kết qả khảo sát các thành phần pha động
Hệ pha động Tín hiệu pic (cps)
Đặc điểm pic Kênh A (90%) Kênh B (10%) CAP FF
MeOH H2O 480 950 Pic nhọn nhƣng chƣa tách
MeOH CH3COOH 0,1% 3160 9768 Pic nhọn nhƣng chƣa tách MeOH CH3COONH4 0,1% 2420 7680 Pic nhọn nhƣng chƣa tách ACN H2O 18 32 Tín hiệu đƣờng nền ACN CH3COOH 0,1% 240 720 Pic chẻ và chƣa tách ACN CH3COONH4 0,1% 920 1280 Pic chẻ và chƣa tách
Từ kết quả khảo sát trên ta thấy hệ pha động với kênh B là MeOH đều cho tín hiệu và đặc điểm pic tốt hơn là ACN. Hệ pha động với MeOH và các chất khác thì tín hiệu tốt nhất là kết hợp với CH3COOH 0,1%. Trong các dung dịch khảo sát ở kênh A thì độ phân cực tăng dần từ H2O, CH3COOH tới CH3COONH4. Nhƣ vậy nhóm chất phenicol này có độ phân cực trung bình phù hợp với hệ pha động MeOH và CH3COOH nhất.
Song nhƣ chúng ta thấy hai mảnh định lƣợng của CAP và FF trong tất cả các sắc đồ trên đều chƣa tách đƣợc khỏi nhau. Vì thế chúng tôi tiếp tục tìm điều kiện tối ƣu với các khảo sát về tỉ lệ pha động và chƣơng trình Gradient.
b/Tỉ lệ pha động
Chúng tôi tiến hành chọn các mức khảo sát giữa tỉ lệ MeOH và CH3COOH từ 30 tới 90% MeOH. Kết quả khảo sát với các sắc đồ tƣơng ứng nhƣ sau:
Hình 3.7 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha động
Hình 3.8 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha động
khảo sát MeOH:CH3COOH 0,1% = 50:50 (v/v)
Hình 3.9 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha động
Hình 3.10 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha
động khảo sát MeOH:CH3COOH 0,1% = 70:30 (v/v)
Hình 3.11 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha
Hình 3.12 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha
động khảo sát MeOH:CH3COOH 0,1% = 90:10 (v/v)
Kết quả trên sắc đồ chúng tôi tổng kết theo bảng sau:
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát tỉ lệ pha động
Tỉ lệ pha động MeOH:CH3COOH
0,1% (v/v)
Cƣờng độ tín
hiệu (cps) Thời gian lƣu Đặc điểm pic
CAP FF CAP FF
30:50 24 30 - - Tín hiệu đƣờng nền 50:50 280 2224 8,33 1,83 Không rõ pic 60:40 944 3444 9,30 4,66 Pic doãng và rất xấu
70:30 2272 6532 3,70 2,44 Hai pic đã tách khỏi nhau, đầu pic còn chẻ nhiều.
80:20 2888 1,1e4 2,82 2,29 Hai pic tách khỏi nhau, đầu pic chẻ ít.
90:10 1,5e4 6,5e4 1,35 1,29 Hai pic nhọn nhƣng không tách khỏi nhau Nhƣ vậy khi càng tăng tỉ lệ MeOH đồng nghĩa với độ phân cực giảm đi (vì CH3COOH có độ phân cực cao hơn MeOH) thì tín hiệu pic ra càng tốt, nghĩa là khả năng hòa tan của nhóm phenicol trong dung môi phân cực vừa nhƣ MeOH tốt hơn rất nhiều. Khi tỉ lệ MeOH:CH3COOH là 90:10 (v/v) thì tín hiệu là tốt nhất, tuy nhiên do lúc này cả hai chất CAP và FF đều bị hòa tan mạnh nhƣ nhau dẫn tới tốc độ di chuyển của chúng trong pha động là giống nhau và không tách ra khỏi nhau, hơn nữa thời gian lƣu ở đây nhỏ - chất phân tích ra sớm dễ bị ảnh hƣởng bởi tạp chất . Ở tỉ lệ MeOH thấp thì khả năng hòa tan của CAP và FF có sự khác nhau rõ rệt, dẫn tới chúng dễ dàng tách ra khỏi nhau nhƣng tín hiệu pic lại thấp và pic rất xấu, đồng thời thời gian lƣu tăng lên gây tốn dung môi và tăng thời gian phân tích. Theo kết quả trên chỉ có tỉ lệ 80% dung môi MeOH có thể tạm chấp nhận đƣợc.
c/ Chƣơng trình Gradient
Nhƣ trên ta thấy nếu chạy với tỉ lệ pha động cố định (theo tối ƣu ở trên là MeOH:CH3COOH 0,1% = 80:20) thì không thể vừa cho thời gian lƣu phù hợp mà lại vừa cho tín hiệu cao và pic đẹp. Do đó để kiểm soát thời gian lƣu sao cho các chất đi ra ở giữa sắc đồ (trong khoảng thời gian khảo sát 10 phút cho một sắc đồ), nghĩa là tỉ lệ dung môi khảo sát tăng dần MeOH và đạt 100% trong khoảng thời gian từ 4 đến 6 phút, sau đó sẽ giảm dần tỉ lệ MeOH xuống, đồng thời với thời gian nhƣ vậy, các tạp chất đƣợc loại ở thời gian đầu và thời gian cuối của sắc đồ giúp giảm thiểu đƣợc nhiễm chéo khi chạy các mẫu liên tục. Và với chế độ chạy nhƣ vậy
tỉ lệ 2 kênh sử dụng là tƣơng đƣơng nhau, giảm lƣợng dung môi MeOH xuống so với trƣờng hợp ta chọn chế độ cố định với tỉ lệ 80% MeOH.
Trên cơ sở lập luận trên chúng tôi khảo sát pha động theo một số chƣơng trình gradient (đẳng dòng 0,4ml/phút) và tối ƣu đƣợc nhƣ bảng sau:
Bảng 3.7 Chương trình gradient tối ưu cho pha động phân tích CAP và FF
Thời gian (phút) Kênh B: MeOH Kênh A: CH3COOH 0,1%
0,01 20 80
4 100 0
6 100 0
6,01 20 80
Chƣơng trình gradient trên cho sắc đồ nhƣ sau:
Hình 3.13 Sắc đồ các 2 mảnh ion con định lượng của FF và CAP (lần lượt theo thứ tự từ trái sang phải) khi chạy chương trình gradient ở bảng 3.7
Sắc đồ trên cho thấy hai pic đã tách khỏi nhau hoàn toàn, tín hiệu khá cao, pic nhọn, đẹp.
d/ Tốc độ dòng pha động
Tốc độ dòng cũng là một yếu tố ảnh hƣởng lên quá trình phân tách, thời gian lƣu của các chất. Và nó cũng là một yếu tố ảnh hƣởng tới áp lực đầu cột tách. Đối với máy sắc ký khối phổ mà chúng tôi nghiên cứu, tốc độ dòng khi cho qua cột thƣờng đƣợc khuyến cáo sao cho áp suất đầu cột không đƣợc vƣợt quá 500 bar và thông thƣờng dòng tổng ≤ 0,5ml/phút
Theo hệ pha động và chƣơng trình gradient trên với tốc độ dòng tổng 4ml/phút, sắc đồ và tín hiệu đã ổn định và khá đẹp.
Tuy nhiên chúng tôi thử tiến hành khảo sát chƣơng trình gradient trên ở những tốc độ dòng khác nhau để tối ƣu hóa tối đa các yếu tố. Tiến hành khảo sát tốc độ dòng lần lƣợt là 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml/phút chúng tôi thu đƣợc các sắc đồ nhƣ sau:
Hình 3.14 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,2mL/phút
Hình 3.15 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,3mL/phút
Hình 3.16 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,4mL/phút
Hình 3.17 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,5mL/phút
Kết quả khảo sát đƣợc tổng hợp trong bảng sau:
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát tốc độ dòng pha động
Tốc độ dòng (ml/phút)
Cƣờng độ tín hiệu (cps) Thời gian lƣu (phút)
CAP FF CAP FF
0,2 3368 7696 8,19 7,5
0,3 1324 6100 6,50 5,9
0,4 2144 5000 5,93 5,3
0,5 1556 3632 5,73 5,05
Ta thấy khi tăng tốc độ dòng thì thời gian lƣu giảm đi, nhƣng đồng thời tín hiệu cũng giảm đi tƣơng đối (trừ trƣờng hợp tín hiệu của CAP khi tốc độ dòng là 0,3 ml/phút). Theo bảng kết quả trên để có thời gian lƣu phù hợp và tín hiệu tƣơng đối rõ chúng tôi vẫn chọn tốc độ dòng tối ƣu là 0,4 mL/phút.
Từ các kết quả khảo sát về điều kiện chạy máy LC/MS/MS chúng tôi đƣa ra các thông số điều kiện tối ƣu cho phân tích CAP và FF nhƣ sau:
Cột Symestry C18 của Water (150mm x 4,6mm x 5mm).
Thành phần pha động: Kênh A là dung dịch acid axetic 0,1% trong nước, kênh B là dung môi MeOH.
Chương trình chạy gradient ở bảng 3.7.
Tốc độ dòng 0,4ml/phút.
Detector MS/MS với các thông số ở bảng 3.1 và 3.3.
Các kết quả tối ƣu trên đƣợc chúng tôi áp dụng khi chạy các khảo sát về điều kiện tách chiết, xử lý mẫu và đánh giá phƣơng pháp.
3.2. Đánh giá phƣơng pháp
3.2.1 Khoảng tuyến tính và lập đƣờng chuẩn
Lập đƣờng chuẩn là một trong những yêu cầu đầu tiên của phƣơng pháp phân tích. Từ đƣờng chuẩn ta có thể biết đƣợc khoảng tuyến tính của chất phân tích, từ đó đƣa nồng độ mẫu thực nằm trong khoảng tuyến tính. Nhƣ ở chƣơng 2 đã nói tới do CAP cần phải kiểm soát nồng độ sao cho tiến về mức 0, còn FF lại ở mức 200ppb (cao hơn rất nhiều lần so với CAP) đồng thời các mẫu tồn dƣ nếu có FF thƣờng ở mức cao, nhƣng mặt khác theo các kết quả khảo sát ở 3.1 ta thấy tín hiệu đáp ứng của FF với máy cao hơn là CAP khi ở cùng nồng độ (khoảng 2 đến 5 lần). Tuy nhiên so với sự chênh lệch về giá trị MRL cần kiểm soát thì nó là không đáng kể. Vì vậy để có thể phân tích đồng thời hai chất trên, chúng tôi đã tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đƣờng chuẩn trong khoảng sau: pha một dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ từ 0,05 đến 3ppb đối với CAP và từ 5 đến 300ppb đối với FF từ dung dịch chuẩn trung gian 1ppm. Các dung dịch chuẩn đƣợc pha trong Methanol. Sau đó đem đo trong điều kiện đã tối ƣu ở 3.1, kết quả thu đƣợc ở bảng sau
Bảng 3.9 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Phenicol
Nồng độ CAP
(ppb) Diện tích pic Nồng độ FF (ppb) Diện tích pic
0,05 1324 5 153000 0,10 2030 10 285000 0,20 3430 20 586000 0,50 8540 50 1350000 1,00 15200 100 2730000 2,00 32200 200 5310000 3,00 47100 300 7360000
Các dữ liệu trên xử lý trên phần mềm Excel chúng tôi thu đƣợc đồ thị sau:
Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ CAP
y = 6E-05x - 0.0256 R2 = 0.9994 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 10000 20000 30000 40000 50000 Diện tích pic N ồ n g đ ộ
Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ FF y = 4E-05x - 4.1512 R2 = 0.9973 0 50 100 150 200 250 300 350 0 100000 0 200000 0 300000 0 400000 0 500000 0 600000 0 700000 0 800000 0 Diện tích N ồn g độ
Nhƣ vậy với hai chuẩn CAP và FF của nhóm phenicol trong khoảng nồng độ chúng tôi khảo sát đều tuyến tính. Do đó hai đồ thị trên cũng chính là đƣờng chuẩn của CAP và FF, khoảng nồng độ chúng tôi khảo sát ở trên là tuyến tính và đƣợc áp dụng cho các khảo sát khác.
Tuy nhiên trong quá trình khảo sát tiếp theo, ở những mức thêm chuẩn khác nhau, chúng tôi sẽ sử dụng kết quả trên để lập đƣờng chuẩn trong những khoảng nhỏ hơn phù hợp với nồng độ thêm chuẩn trên nền mẫu.
3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng pháp pháp
Để xác định giới hạn phát hiện, chúng tôi dùng chuẩn hỗn hợp CAP và FF 2ppb rồi tiến hành thêm chuẩn trên nền mẫu thực (cũng là mẫu trắng không chứa chất phân tích) để nồng độ cuối cùng (sau khi qua tất cả các bƣớc xử lý mẫu) thu đƣợc ở các mức khác nhau (và <2ppb). Tiến hành đo chất phân tích thu đƣợc sắc đồ. Từ sắc đồ chúng tôi đo tỉ số tín hiệu/nhiễu.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định LOD dựa trên tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N). Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích; N là nhiễu đƣờng nền
LOD đƣợc chấp nhận là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu đƣờng nền (S/N=3).
Cũng theo phƣơng pháp này LOQ đƣợc chấp nhận là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đƣờng nền (S/N = 10)
Nhƣ vậy LOQ = 3,3 LOD
Hình 3.18 Sắc đồ hai mảnh định lượngcủa CAP và FF thêm chuẩn trên nền mẫu trắng phương pháp với nồng độ 0,03 ng/ml
Theo sắc đồ trên: - Với CAP: S/N = 2H/h = 68x2/40 = 3,4 - Với FF: S/N = 2H/h = 240x2/50 = 9,6
Vậy sắc đồ trên tƣơng ứng với LOD của CAP và LOQ của FF. Từ kết quả này có thể thấy giới hạn phát hiện (LOD) của phƣơng pháp đối với CAP là 0,03 ng/ml tƣơng ứng với giới hạn định lƣợng LOQ = 0,03x3,3 = 0,1ng/ml.
Giới hạn định lƣợng đối với FF = 0,03ng/ml tƣơng ứng cho giới hạn phát hiện LOD=LOQ/3,3 = 0,01ng/ml.
Tính toán theo 2.2.5.e, ta thu đƣợc giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp trên nền mẫu thực (ng chất phan tích/g mẫu thực) nhƣ sau:
CAP : LOD 0,009ng/g; LOQ 0,03ng/g FF: LOD 0,003ng/g; LOQ 0,009ng/g
3.2.3 Độ chính xác của phép đo
Theo ISO, độ chính xác của phép đo đƣợc đánh giá qua độ đúng và độ chụm. Độ chụm là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực. Độ đúng đƣợc biểu diễn dƣới dạng sai số tuyệt đối hoặc sai số tƣơng đối.
Sai số đƣợc tính theo công thức:
% 100 % t t i S S S X n X X n i i tb 1 % %
Trong đó: %X : Sai số phần trăm tƣơng đối. Si : giá trị diện tích pic đo đƣợc.
St : giá trị diện tích pic tìm đƣợc theo đƣờng chuẩn. N : số lần đo.
Độ lặp lại của phép đo đƣợc xác định theo các đại lƣợng S2 và CV.
2 S 1 ) ( 2 n S Si tb 100 tb S S CV Trong đó: Stb : Diện tích pic trung bình.
N : số lần đo. S : độ lệch chuẩn.
CV : hệ số biến động của phép đo.
Để đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo ta dựng đƣờng chuẩn, pha 3 mẫu có nồng độ ở điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối của khoảng tuyến tính, mỗi mẫu đo lặp lại 4 lần với các điều kiện đã tối ƣu ở 3.1. Các kết quả đƣợc chỉ ra trong bảng dƣới đây
Bảng 3.10 Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau
Nồng độ (ppb) Diện tích pic X% CV Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 St CAP 0,1 2030 2100 2080 2050 2093 1,50 1,51 1 16200 16100 16300 17200 17093 4,07 3,08 3 48100 50200 49100 50300 50426 1,98 2,10 FF 10 335000 346000 378000 325000 353780 5,62 6,65 100 2720000 2690000 2730000 2720000 2603780 4,27 0,64 300 7360000 7350000 7370000 7360000 7603780 3,21 0,11 Nhận xét: Phần trăm sai số và hệ số biến thiên CV của phép đo tại 3 mức nồng độ 10ppb, 100ppb và 300ppb đối với FF và 0,1; 1; 3 có giá trị từ 1,2 – 7,6% đều nằm trong giới hạn cho phép của AOAC.