d/ Tốc độ dòng pha động
3.4Phân tích các mẫu thực tế
Thêm chuẩn hỗn hợp CAP và FF + 20ml Etyl axetat
Lắc vortex 5 phút
Ly tâm 6000v/phút (5 phút)
Gạn lớp trên vào bình cô quay 100ml, cô quay tới cạn ở 400
C Phần cắn Chiết lặp với 10ml EtA Hòa cắn bằng 12 ml CH3COONH4 4%
Loại béo bằng 5 ml n-hexan, chiết lặp hai lần Cân 10g mẫu/ ống ly tâm 50ml
Đồng nhất
Qua cột chiết pha rắn C18 - Hoạt hóa =3ml H20 và 3ml MeOH
-Nạp mẫu
- Rửa tạp bằng 2ml H2O - Rửa giải bằng 3ml MeOH
Sau khi nghiên cứu tối ƣu phƣơng pháp phân tích. Để củng cố với các đối tƣợng tôm, thịt gà, thịt lợn; chúng tôi tiến hành sƣu tầm mẫu trắng (là mẫu từ động vật chỉ nuôi bằng nguồn thức ăn không bổ sung nhóm kháng sinh này), phân tích lặp 3 lần và thu đƣợc độ thu hồi trên các nền mẫu đó đều đảm bảo khả năng định lƣợng của phƣơng pháp: Độ thu hồi trung bình trên nền mẫu trắng thịt lợn, gà, tôm ở mức nồng độ 1ppb đều cao hơn 80%
Chúng tôi thu thập tiếp khoảng 22 mẫu thịt đƣợc bán tại chợ ở các quận huyện Long Biên, Gia Lâm, Hoàng Mai, Đông Anh trong khoảng thời gian tháng 8, 9 năm 2011. Tiến hành xử lý mẫu nhƣ trong chƣơng 2 đã đề cập, sử dụng phƣơng pháp nghiên cứu, chúng tôi thu đƣợc kết quả phân tích theo bảng sau:
Mẫu Nồng độ phân tích trong mẫu (ng/g mẫu)
CAP FF Thịt lợn mẫu trắng KPH KPH Thịt lợn 1 (CGL2) KPH KPH Thịt lợn 2 (DAL5) KPH KPH Thịt lợn 3 (DAL8) 0,46 KPH Thịt lợn 4 (CGL6) KPH KPH Thịt lợn 5 (DAL6) KPH 403 Thịt lợn 6 (VDL) KPH KPH Cá mẫu trắng KPH KPH Cá 1 (FHN1) KPH KPH Cá 2 (FHN12) 0,46 0,66 Cá 3 (FHN10) KPH KPH Cá 4 (FHN8) KPH KPH
Cá 5 (FHN4) KPH KPH Cá 6 (FHN6) 0,03 KPH Cá 7 (FVD) 0,44 KPH Tôm mẫu trắng KPH KPH Tôm 1 (SHN2) KPH KPH Tôm 2 (SHN5) KPH KPH Tôm 3 (SHN6) KPH KPH Tôm 4 (SHN17) KPH KPH Tôm 5 (SHN12) KPH 0,3 Tôm 6 (SHN8) 0,12 KPH Tôm 7 (SVD) KPH KPH Thịt gà trắng KPH KPH Thịt gà 1 (DAG1) 0,02 KPH Thịt gà 2 (GNC) KPH KPH
Trong số 22 mẫu khảo sát thì phát hiện thấy 6/22 mẫu dƣơng tính với Chloramphenicol tuy nồng độ định lƣợng đƣợc không cao 0,02 đến 0,46ng/g mẫu; và 3/22 mẫu dƣơng tính với FF đặc biệt mẫu DAL6 có hàm lƣợng FF rất cao vƣợt giới hạn tồn dƣ cho phép của EU. Các nền mẫu khác nhau ở mức thêm chuẩn 1ng/ml đều lớn hơn 80%.
Chƣơng 4: KẾT LUẬN
Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm đã nghiên cứu để xác định dƣ lƣợng kháng sinh nhóm phenicol trong một số loại thịt làm thực phẩm phổ biến bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ, chúng tôi đã thu đƣợc các kết quả sau:
1. Nghiên cứu và tối ƣu hóa đƣợc các điều kiện chạy sắc ký lỏng khối phổ nhƣ: pha động, cột sắc ký, detector.
2. Nghiên cứu và đánh giá đƣợc khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của Chloramphenicol và Florfenicol, độ lặp lại và độ thu hồi của phƣơng pháp.
3. Nghiên cứu và đƣa ra điều kiện để tách chiết CAP và FF trong một số loại thịt làm thực phẩm.
4. Đƣa ra quy trình phân tích xác định đồng thời tồn dƣ kháng sinh CAP và FF trong một số loại thực phẩm tƣơi sống bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ.
5. Tiến hành phân tích trên 22 mẫu thịt và mẫu trắng đối chứng trên địa bàn Hà Nội, xác định độ thu hồi trên các nền mẫu khác nhau. Từ các kết quả thu đƣợc chúng tôi nhận thấy có thể áp dụng phân tích tồn dƣ kháng sinh nhóm phenicol với độ tin cậy cao. Đây là một phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm trong phân tích đồng thời nhóm phenicol mặc dù chi phí cho phân tích còn khá cao. Nếu có thể, tôi mong tiếp tục nghiên cứu xác định đồng thời hai chất còn lại (ít phổ biến hơn) thuộc nhóm phenicol.
TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tiếng Việt
1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2009), Quyết định số 15/2009/TT- BNN ngày 17 tháng 3 năm 2009, Cấm một số hóa chất, kháng sinh trong nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng thuốc thú y.
2. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2010), Thông tƣ 69/2010/TT- BNNPTNT ngày 03 tháng 12 năm 2010. Danh mục thuốc thú y, chế phẩm sinh học, vi sinh vật, hóa chất dùng trong thú y thủy sản đƣợc phép lƣu hành tại Việt Nam. 3. Bộ Thủy sản (2006), Công điện của Bộ trƣởng Bộ thủy sản số: 01/BTS-VP, ngày 12 tháng 9 năm 2006.
4. Bộ Y tế (2007), Quyết định số 03/2002QD-BTS, Quy chế quản lý thuốc thú y và các hóa chất sử dụng trong nuôi trồng thủy sản.
5. Phạm Kim Đăng, Marie-Louise Sippo, Guy Degand, Caroline Douny, Guy Maghuin-Rogister (2007), “Chuẩn hóa phƣơng pháp sàng lọc định tính kiểm soát tồn dƣ kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc động vật theo quy định số 2002/657/EC (bài tổng hợp)“, Tạp chí KHKT Nông nghiệp, ĐHNN I, tập V, số
1/2007, tr.24-30.
6. Phạm Kim Đăng, Guy Degand, Phạm Hồng Ngân, Guy Maghuin-Rogister, Marie-Louise Scippo (2008), “Ứng dụng phƣơng pháp ELISA để phân tích tồn dƣ kháng sinh nhóm quynolone trong tôm tại một số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc“.
Tạp chí Khoa học và Phát triển, ĐHNN HN, tập VI, số 3/2008; tr.261-267. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7. Phạm Kim Đăng (2011), Nghiên cứu ứng dụng phương pháp vi sinh vật phát
hiện dư lượng một số nhóm kháng sinh trong tôm, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học
và công nghệ cấp bộ, Hà Nội.
8. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào
kiểm nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên, NXB Y
học, Thành phố Hồ Chí Minh.
9. Phạm Khắc Hiếu, Lê Thị Ngọc Diệp (1997), Giáo trình dược lý học, NXB
10. Phạm Khắc Hiếu, Lê Thị Ngọc Diệp (1999), Dược lý học thú y, NXB Nông
nghiệp, Hà Nội.
11. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2003),
Giáo trình môn học Hóa học phân tích (phần 2 Các phương pháp phân tích công cụ), Khoa Hóa học – Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN, Hà Nội.
12. Hoàng Tích Huyền, Đào Văn Phán, Nguyễn Trọng Thông (2001), Giáo trình dược lý học, NXB Y học, Hà Nội.
13. Nguyễn Văn Kiệm, Phạm Kim Đăng (2009), “Ảnh hƣởng của thức ăn công nghiệp đến tăng trọng, chất lƣợng, tồn dƣ kim loại nặng và kháng sinh trong thịt lợn“, Tạp chí khoa học và phát triển, ĐHNNHN, Tập VII, Số 4/2009; tr 476 – 483. 14. Trƣơng Công Quyền (1972), Sơ lược kháng sinh, Phòng nghiên cứu kháng
sinh trƣờng Đại học Dƣợc khoa, tr.2-5.
15. Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình môn học Các phương pháp tách, Khoa Hóa học – Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN, Hà Nội.
16. Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình môn học Thống kê trong hóa phân tích, Khoa Hóa học – Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN, Hà Nội.
17. Phạm Hùng Việt (2005), Sắc ký khí – Cơ sở lý thuyết và khả năng ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
B. Tiếng Anh
18. Barbara K. Neuhaus, Jeffrey A. Hurlbut and Walter Hammack (2002), “LC/MS/MS Analysis of Chloramphenicol in Shrimp”, FDA/ORA/DFS, No 4290. 19. Bogaerts, R., Wolf, F (1980). “A standardized method for the detection of residues of antibacterial substances in fresh meat – A report of the working group of the Scientific Veterinary Commission of the European Communities concerning a proposal for a common microbiological method, the so-called EEC four-plate method”, Fleischwirtschaft, 1980, 60, pp. 667-669.
20. Chukwuenweniwe J Eboka, Johnson Smart and Sunday A Adelusi (2003), “An alternative colorimetric method for the determination of chloramphenicol”, Tropical
Journal of Pharmaceutical Research, December 2003, 2(2), pp. 215-221.
21. Cooper, A. D., Tarbin, J. A., Farrington, W. H. H., Shearer, G. (1998). “Effects of extraction and spiking procedures on the determination of incurred residues of oxytetracycline in cattle kidney”, Food Additives and Contaminants, 15, pp. 645-650.
22. Fuad Al-Rimawi and Maher Kharoaf (2011), “Analysis of chloramphenicol and its related Compound 2-Amino-1-(4-nitrophenyl)propane-1,3-diol by Reversed- Phase High-Performance Liquid Chromatography with UV-Detection”,
Chromatography Research International, Vol 2011, Acticle ID 482308.
23. James S. Stuart, Heidi S. Rupp and Jeffery A. Hurlbut (2003), “LC/MS/MS Analysis of Chloramphenicol in Crawfish Meat”, FDA/ORA/DFS, No 4303.
24. Koenen-Dierick, K., Okerman, L., Zutter, L.D., Degroodt, J. M., Hoof, J.V., Srebrnik, S. (1995), “A one-plate microbiological screening test for antibiotic residue testing in kidney tissue and meat: an alternative to the EEC four-plate method?”, Food Additives and Contaminants, 1995, 12, pp. 77-82.
25. Limian Zhao, Carol Haney Ball (2004), Determination of Chloramphenicol, Florfenicol, and Thiamphenicol in Honey Using Agilent SampliQ OPT Solid-Phase Extraction Cartridges and Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry,
Applycation note, Agilent Technologies, USA.
26. Maximum Residue Limit, http ://www.mrldatabase.com 27. MS/MS, Http://www.appliedbiosystems.com/service/training/
28. Myllyniemi, A.L., Rintala, R., Backman, C., Niemi, A. (1999), “Microbiological and chemical identification of antimicrobial drugs in kidney and muscle samples of bovine cattle and pigs”, Food additives & Contaminants, 16, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
339-351.
30. Rebecca S. Nicolich, Eduardo Werneck-Barroso, Marlice A. Sípoli Marques (2006), “Food safety evaluation: Detection and confirmation of chloramphenicol in milk by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry”,
Analytica Chimica Acta, 565, pp. 97-102.
31. Robert L. Thies and Lawrence J.Fischer (1978), “High Performance Liquid- Chromatographic Assay for Chloramphenicol in Biological Fluids”, Clinical Chemistry, 24(5), pp. 778-781.
PHỤ LỤC
Sắc đồ chạy dung môi và phân tích một số mẫu thực tế
Sắc đồ 6 mảnh định tính và định lượng của CAP và FF khi chạy dung môi MeOH
Sắc đồ 6 mảnh định tính và định lượng của CAP và FF khi chạy mẫu trắng hóa chất (reagent blank)
Sắc đồ 6 mảnh định tính và định lƣợng của CAP và FF khi chạy nền mẫu cá trắng
Sắc đồ phân tích mẫu tôm SHN12 (dƣơng tính FF )