Kết quả thực nghiệm đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê, sử dụng phần mềm Excel 2003 và Minitab 14.0
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ƣu điều kiện xác định Phenicol trên thiết bị LC/MS/MS
3.1.1 Tối ưu các điều kiện chạy của detector khối phổ (MS)
Các chất thuộc nhóm phenicol có khối lƣợng phân tử và độ phân cực trung bình. Qua tham khảo một số tài liệu [18, 23, 27] chúng tôi tiến hành khảo sát xác định CAP và FF bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion âm.
Để tối ƣu hóa điều kiện khối phổ, dùng xiranh 500μl bơm từng chuẩn CAP và FF 10ppb vào detector để khảo sát. Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất CAP và FF, tối ƣu hóa từng ion mẹ ta đƣợc điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI nhƣ sau:
Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI
Thế phun điện tử 4,0 kV Nhiệt độ đầu phun (IS) 300 0C Khí che (CUR) 30 miliTorr Khí va chạm (CAD) 7 miliTorr Nguồn khí ion 1 (GS1) 20 psi Nguồn khí ion 2 (GS1) 10 psi Thế phân nhóm (DP) -100V
Thế đầu vào (Entrance Potential) (EP) -10V
Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion âm, các ion mẹ có dạng (M-2). Bảng dƣới đây là kết quả khảo sát bắn phá ion mẹ của CAP và FF:
Bảng 3.2 Kết quả bắn phá ion mẹ
Chất Khối lƣợng phân tử M Ion mẹ
CAP 323,13 320,972
FF 358,21 355,926
Detector đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này là khối phổ hai lần, do đó để phát hiện đúng chất phân tích thì việc chọn đƣợc ion con là rất quan trọng. Ion con phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ.
Khảo sát điều kiện bắn phá và phân mảnh tạo các ion con, chúng tôi tiến hành chọn chế độ khảo sát nhƣ sau:
- Quét 5 mảnh cho cƣờng độ tín hiệu cao nhất
- Thế phân nhóm (Declustering Potential) trong khoảng từ -150 đến -1(V), với bƣớc quét (step) là 5 (V)
- Năng lƣợng va chạm (Collision Energy) trong khoảng từ -130 đến -5 (V), bƣớc quét là 2 (V)
- Năng lƣợng CXP (Collision Cell Exit Potential) trong khoảng từ -55,0 đến 0 (V), bƣớc quét : 2(V)
Kết quả tối ƣu tự động trên máy (tín hiệu ổn định và nhạy) cho theo bảng dƣới đây (chạy lặp 5 lần và lấy kết quả trung bình) :
Bảng 3.3 Kết quả tối ưu tự động các điều kiện chạy MS/MS
Ion mẹ Ion con DP (V) CE (V) CXP (V) Cƣờng độ tín
hiệu (cps) CAP 320,972 257,192 -100 -14 -17 75530 194,422 -100 -16 -17 24450 152,221 -100 -22 -11 105940
46,310 -100 -82 -5 20390 35,312 -100 -44 -15 19330 FF 355,926 336,000 -100 -12 -25 500590 219,100 -100 -14 -13 51510 185,177 -100 -26 -17 278620 119,200 -100 -32 -13 74600 79,200 -100 -34 -11 38150
Kết quả trên chỉ ra các mảnh ion con đặc trƣng và điều kiện tối ƣu cho từng mảnh của mỗi chất phân tích. Căn cứ theo cƣờng độ tín hiệu phân tích và khoảng thế (DP và CXP) cũng nhƣ năng lƣợng va chạm (CE) phù hợp trong giới hạn cho phép của máy, chúng tôi lựa chọn 3 mảnh đặc trƣng cho mỗi chất và các điều kiện để phân tích định tính và định lƣợng nhƣ sau:
Bảng 3.4 Các thông số tối ưu cho phân tích định tính và định lượng CAP và FF trên MS/MS
Ion mẹ Ion con DP CE CXP
Tốc độ quét (msec) CAP 321 257 -100 -14 -17 250 194 -100 -16 -17 250 152 -100 -22 -11 250
FF 356 336 -100 -12 -25 250
219 -100 -14 -13 250
185 -100 -26 -17 250 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đó hai mảnh chính có tín hiệu cao nhất và ổn định đƣợc chúng tôi dùng để định lƣợng hai hợp chất trong các khảo sát tiếp theo là mảnh 152 đối với CAP và 336 đối với FF.
Kết quả khảo sát trên tiến hành ở cùng một nồng độ đối với cả hai chất nhƣng tín hiệu của CAP đáp ứng trên máy thấp hơn khoảng gần 2 đến 4 lần so với FF. Trong khi đó CAP cần đƣợc kiểm soát ở mức tiến tới 0, thấp hơn rất nhiều lần so với FF (200 tới 300 ppb) nên khi khảo sát trên mẫu thực chúng tôi sẽ khảo sát tỉ lệ thêm chuẩn để có sắc đồ cũng nhƣ để xử lý kết quả phân tích giảm thiểu sai số.
3.1.2 Pha tĩnh
Cột tách vốn là trái tim của hệ sắc ký, nó có vai trò quan trọng trong việc tách các chất khỏi nhau. Các chất nhóm Phenicol có độ phân cực trung bình, đồng thời theo khuyến cáo của nhà sản xuất thiết bị khối phổ thì hệ pha động sử dụng an toàn với thiết bị là các dung môi phân cực và phân cực vừa gồm có Methanol, Axetonitril, Nƣớc, axit Formic (0 đến 1%), Amoniaxetat (0 tới 1%)… Do đó chúng tôi lựa chọn cột tách pha đảo. Hơn nữa, hệ dung môi phân cực thƣờng có tính kinh tế cao, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn cột C18 để tách hai chất CAP và FF của nhóm phenicol. Để bảo vệ cột, chúng tôi sử dụng thêm tiền cột. Thông số cột tách và tiền cột nhƣ sau:
Cột Symestry Shield C18 của Water (150mm x 4,6mm x 5mm). Tiền cột Symestry C18 của Water (20 mm x 3,9 mm x 5mm).
3.1.3 Khảo sát hệ pha động và chƣơng trình gradient a/ Thành phần pha động a/ Thành phần pha động
Trong phƣơng pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hƣởng tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hƣởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích. Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion âm, quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất nhƣ acid acetic, acid focmic. Dùng dung dịch chuẩn hỗn hợp CAP và FF 2ppb để khảo sát thành phần pha động, các điều kiện chạy máy đƣợc cố định nhƣ sau:
- Cột Symestry Shield Water C18 và tiền cột. - Detector: khối phổ.
- Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút.
- Pha động: kênh B lần lƣợt là methanol, Axetonitrin, kênh A lần lƣợt là axit acetic 0,1%, CH3COONH4 0,1% trong nƣớc, Nƣớc.
- Tỉ lệ kênh A:kênh B = 10:90 (v/v)
Kết quả khảo sát ở dạng tín hiệu pic cho bởi các sắc đồ sau đây:
Hình 3.1 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha độngkhảo sát MeOH – CH3COOH 0,1%
Hình 3.2 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát
MeOH – H2O
Hình 3.3 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát MeOH
Hình 3.4 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát
ACN – H20
Hình 3.5 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát
ACN – CH3COOH 0,1%
Hình 3.6 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát
Chúng tôi tổng kết trong bảng sau:
Bảng 3.5 Kết qả khảo sát các thành phần pha động
Hệ pha động Tín hiệu pic (cps)
Đặc điểm pic Kênh A (90%) Kênh B (10%) CAP FF
MeOH H2O 480 950 Pic nhọn nhƣng chƣa tách
MeOH CH3COOH 0,1% 3160 9768 Pic nhọn nhƣng chƣa tách MeOH CH3COONH4 0,1% 2420 7680 Pic nhọn nhƣng chƣa tách ACN H2O 18 32 Tín hiệu đƣờng nền ACN CH3COOH 0,1% 240 720 Pic chẻ và chƣa tách ACN CH3COONH4 0,1% 920 1280 Pic chẻ và chƣa tách
Từ kết quả khảo sát trên ta thấy hệ pha động với kênh B là MeOH đều cho tín hiệu và đặc điểm pic tốt hơn là ACN. Hệ pha động với MeOH và các chất khác thì tín hiệu tốt nhất là kết hợp với CH3COOH 0,1%. Trong các dung dịch khảo sát ở kênh A thì độ phân cực tăng dần từ H2O, CH3COOH tới CH3COONH4. Nhƣ vậy nhóm chất phenicol này có độ phân cực trung bình phù hợp với hệ pha động MeOH và CH3COOH nhất.
Song nhƣ chúng ta thấy hai mảnh định lƣợng của CAP và FF trong tất cả các sắc đồ trên đều chƣa tách đƣợc khỏi nhau. Vì thế chúng tôi tiếp tục tìm điều kiện tối ƣu với các khảo sát về tỉ lệ pha động và chƣơng trình Gradient.
b/Tỉ lệ pha động (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chúng tôi tiến hành chọn các mức khảo sát giữa tỉ lệ MeOH và CH3COOH từ 30 tới 90% MeOH. Kết quả khảo sát với các sắc đồ tƣơng ứng nhƣ sau:
Hình 3.7 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha động
Hình 3.8 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha động
khảo sát MeOH:CH3COOH 0,1% = 50:50 (v/v)
Hình 3.9 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha động
Hình 3.10 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha
động khảo sát MeOH:CH3COOH 0,1% = 70:30 (v/v)
Hình 3.11 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha
Hình 3.12 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha
động khảo sát MeOH:CH3COOH 0,1% = 90:10 (v/v)
Kết quả trên sắc đồ chúng tôi tổng kết theo bảng sau:
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát tỉ lệ pha động
Tỉ lệ pha động MeOH:CH3COOH
0,1% (v/v)
Cƣờng độ tín
hiệu (cps) Thời gian lƣu Đặc điểm pic
CAP FF CAP FF
30:50 24 30 - - Tín hiệu đƣờng nền 50:50 280 2224 8,33 1,83 Không rõ pic 60:40 944 3444 9,30 4,66 Pic doãng và rất xấu
70:30 2272 6532 3,70 2,44 Hai pic đã tách khỏi nhau, đầu pic còn chẻ nhiều.
80:20 2888 1,1e4 2,82 2,29 Hai pic tách khỏi nhau, đầu pic chẻ ít.
90:10 1,5e4 6,5e4 1,35 1,29 Hai pic nhọn nhƣng không tách khỏi nhau Nhƣ vậy khi càng tăng tỉ lệ MeOH đồng nghĩa với độ phân cực giảm đi (vì CH3COOH có độ phân cực cao hơn MeOH) thì tín hiệu pic ra càng tốt, nghĩa là khả năng hòa tan của nhóm phenicol trong dung môi phân cực vừa nhƣ MeOH tốt hơn rất nhiều. Khi tỉ lệ MeOH:CH3COOH là 90:10 (v/v) thì tín hiệu là tốt nhất, tuy nhiên do lúc này cả hai chất CAP và FF đều bị hòa tan mạnh nhƣ nhau dẫn tới tốc độ di chuyển của chúng trong pha động là giống nhau và không tách ra khỏi nhau, hơn nữa thời gian lƣu ở đây nhỏ - chất phân tích ra sớm dễ bị ảnh hƣởng bởi tạp chất . Ở tỉ lệ MeOH thấp thì khả năng hòa tan của CAP và FF có sự khác nhau rõ rệt, dẫn tới chúng dễ dàng tách ra khỏi nhau nhƣng tín hiệu pic lại thấp và pic rất xấu, đồng thời thời gian lƣu tăng lên gây tốn dung môi và tăng thời gian phân tích. Theo kết quả trên chỉ có tỉ lệ 80% dung môi MeOH có thể tạm chấp nhận đƣợc.
c/ Chƣơng trình Gradient
Nhƣ trên ta thấy nếu chạy với tỉ lệ pha động cố định (theo tối ƣu ở trên là MeOH:CH3COOH 0,1% = 80:20) thì không thể vừa cho thời gian lƣu phù hợp mà lại vừa cho tín hiệu cao và pic đẹp. Do đó để kiểm soát thời gian lƣu sao cho các chất đi ra ở giữa sắc đồ (trong khoảng thời gian khảo sát 10 phút cho một sắc đồ), nghĩa là tỉ lệ dung môi khảo sát tăng dần MeOH và đạt 100% trong khoảng thời gian từ 4 đến 6 phút, sau đó sẽ giảm dần tỉ lệ MeOH xuống, đồng thời với thời gian nhƣ vậy, các tạp chất đƣợc loại ở thời gian đầu và thời gian cuối của sắc đồ giúp giảm thiểu đƣợc nhiễm chéo khi chạy các mẫu liên tục. Và với chế độ chạy nhƣ vậy
tỉ lệ 2 kênh sử dụng là tƣơng đƣơng nhau, giảm lƣợng dung môi MeOH xuống so với trƣờng hợp ta chọn chế độ cố định với tỉ lệ 80% MeOH.
Trên cơ sở lập luận trên chúng tôi khảo sát pha động theo một số chƣơng trình gradient (đẳng dòng 0,4ml/phút) và tối ƣu đƣợc nhƣ bảng sau:
Bảng 3.7 Chương trình gradient tối ưu cho pha động phân tích CAP và FF
Thời gian (phút) Kênh B: MeOH Kênh A: CH3COOH 0,1%
0,01 20 80
4 100 0
6 100 0 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
6,01 20 80
Chƣơng trình gradient trên cho sắc đồ nhƣ sau:
Hình 3.13 Sắc đồ các 2 mảnh ion con định lượng của FF và CAP (lần lượt theo thứ tự từ trái sang phải) khi chạy chương trình gradient ở bảng 3.7
Sắc đồ trên cho thấy hai pic đã tách khỏi nhau hoàn toàn, tín hiệu khá cao, pic nhọn, đẹp.
d/ Tốc độ dòng pha động
Tốc độ dòng cũng là một yếu tố ảnh hƣởng lên quá trình phân tách, thời gian lƣu của các chất. Và nó cũng là một yếu tố ảnh hƣởng tới áp lực đầu cột tách. Đối với máy sắc ký khối phổ mà chúng tôi nghiên cứu, tốc độ dòng khi cho qua cột thƣờng đƣợc khuyến cáo sao cho áp suất đầu cột không đƣợc vƣợt quá 500 bar và thông thƣờng dòng tổng ≤ 0,5ml/phút
Theo hệ pha động và chƣơng trình gradient trên với tốc độ dòng tổng 4ml/phút, sắc đồ và tín hiệu đã ổn định và khá đẹp.
Tuy nhiên chúng tôi thử tiến hành khảo sát chƣơng trình gradient trên ở những tốc độ dòng khác nhau để tối ƣu hóa tối đa các yếu tố. Tiến hành khảo sát tốc độ dòng lần lƣợt là 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml/phút chúng tôi thu đƣợc các sắc đồ nhƣ sau:
Hình 3.14 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,2mL/phút
Hình 3.15 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,3mL/phút
Hình 3.16 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,4mL/phút
Hình 3.17 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,5mL/phút
Kết quả khảo sát đƣợc tổng hợp trong bảng sau:
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát tốc độ dòng pha động
Tốc độ dòng (ml/phút)
Cƣờng độ tín hiệu (cps) Thời gian lƣu (phút)
CAP FF CAP FF
0,2 3368 7696 8,19 7,5
0,3 1324 6100 6,50 5,9
0,4 2144 5000 5,93 5,3
0,5 1556 3632 5,73 5,05
Ta thấy khi tăng tốc độ dòng thì thời gian lƣu giảm đi, nhƣng đồng thời tín hiệu cũng giảm đi tƣơng đối (trừ trƣờng hợp tín hiệu của CAP khi tốc độ dòng là 0,3 ml/phút). Theo bảng kết quả trên để có thời gian lƣu phù hợp và tín hiệu tƣơng đối rõ chúng tôi vẫn chọn tốc độ dòng tối ƣu là 0,4 mL/phút.
Từ các kết quả khảo sát về điều kiện chạy máy LC/MS/MS chúng tôi đƣa ra các thông số điều kiện tối ƣu cho phân tích CAP và FF nhƣ sau:
Cột Symestry C18 của Water (150mm x 4,6mm x 5mm).
Thành phần pha động: Kênh A là dung dịch acid axetic 0,1% trong nước, kênh B là dung môi MeOH.
Chương trình chạy gradient ở bảng 3.7.
Tốc độ dòng 0,4ml/phút.
Detector MS/MS với các thông số ở bảng 3.1 và 3.3.
Các kết quả tối ƣu trên đƣợc chúng tôi áp dụng khi chạy các khảo sát về điều kiện tách chiết, xử lý mẫu và đánh giá phƣơng pháp.
3.2. Đánh giá phƣơng pháp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.1 Khoảng tuyến tính và lập đƣờng chuẩn
Lập đƣờng chuẩn là một trong những yêu cầu đầu tiên của phƣơng pháp phân tích. Từ đƣờng chuẩn ta có thể biết đƣợc khoảng tuyến tính của chất phân tích, từ đó đƣa nồng độ mẫu thực nằm trong khoảng tuyến tính. Nhƣ ở chƣơng 2 đã nói tới do CAP cần phải kiểm soát nồng độ sao cho tiến về mức 0, còn FF lại ở mức 200ppb (cao hơn rất nhiều lần so với CAP) đồng thời các mẫu tồn dƣ nếu có FF thƣờng ở mức cao, nhƣng mặt khác theo các kết quả khảo sát ở 3.1 ta thấy tín hiệu đáp ứng của FF với máy cao hơn là CAP khi ở cùng nồng độ (khoảng 2 đến 5 lần). Tuy nhiên so với sự chênh lệch về giá trị MRL cần kiểm soát thì nó là không đáng kể. Vì vậy để có thể phân tích đồng thời hai chất trên, chúng tôi đã tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đƣờng chuẩn trong khoảng sau: pha một dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ từ 0,05 đến 3ppb đối với CAP và từ 5 đến 300ppb đối với FF từ dung dịch chuẩn trung gian 1ppm. Các dung dịch chuẩn đƣợc pha trong Methanol. Sau đó đem đo trong điều kiện đã tối ƣu ở 3.1, kết quả thu đƣợc ở bảng sau
Bảng 3.9 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Phenicol