M Ở đẦ U
2 .M ỤC TIÊU CỦA đỀ TÀI
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu
* Phương pháp theo dõi biểu hiện triệu chứng lâm sàng
Theo dõi tình trạng chung của ựàn gà, phát hiện những biểu hiện khác thường:
- Ăn, uống (nhiều hay ắt hoặc bỏ ăn) - Dáng ựi ựứng, hoạt ựộng của ựàn gà - Nhịp thở
- Màu sắc của mào, tắch, da
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 24 - Trạng thái phân, màu sắc của phân
* Phương pháp mổ khám xét nghiệm
Tất cả các gà mới chết và gà sống có biểu hiện lâm sàng nghi nhiễm
Leucocytozoon ựều ựược tiến hành mổ khám ựể kiểm tra bệnh tắch ựại thể,
kiểm tra trạng thái, màu sắc gan, lách, thận, phổiẦ
* Phương pháp xét nghiệm chỉ tiêu huyết học bằng máy
Chúng tôi lấy máu ở tĩnh mạch cánh của gà nghi nhiễm Leucocytozoon
rồi tiến hành chạy máu ựếm số lượng hồng cầu và bạch cầu bằng máy ựếm huyết học tự ựộng CD Ờ 3700.
* Phương pháp làm tiêu bản máu
- Mẫu máu: Chúng tôi tiến hành lấy máu ở tĩnh mạch cánh của gà vào các buổi sáng (từ 7 Ờ 9 giờ sáng).
- Mẫu tủy xương: Sau khi mổ khám gà ựã ựược chẩn ựoán chắnh xác mắc bệnh ựơn bào Leucocytozoon chúng tôi lấy tủy xương ở ựầu ống xương sống.
Mẫu máu và mẫu tủy xương sau khi ựược lấy chúng tôi tiến hành phết kắnh và cố ựịnh tiêu bản bằng cồn methylic, sau ựó nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm HE, soi kắnh tìm Leucocytozoon.
* Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản, quan sát bệnh tắch vi thể
+Lấy bệnh phẩm: gan, lách, phổi, thậnẦ
+Cốựịnh bệnh phẩm: (Mục ựắch ựể giết chết tổ chức)
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% ựể sau 7 Ờ 10 ngày là có thể sử dụng.
+ Vùi bệnh phẩm: (Tạo ra chất nền cho tổ chức dễ cắt)
Tiến hành lần lượt các bước sau:
- Rửa formol: Lấy tổ chức ra khỏi bình ngâm mẫu, cắt thành miếng theo chiều dài có ựộ dài 4 Ờ 5 mm. Cho vào khuôn ựúc bằng nhựa, ựem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong vòng 24 giờ ựể rửa sạch formol.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 25 - Khử nước (Mục ựắch rửa sạch formol). Cho qua hệ thống 4 lọ cồn.
Cồn I (900I) : 3 giờ. Cồn III (1000I) : 4 giờ Cồn II (900II): 3 giờ. Cồn IV (1000II): 12 giờ - Khử cồn: Cho qua hệ thống 3 lọ xylen.
Xylen I: 4 giờ →Xylen II: 4 giờ →Xylen III: 12 giờ. Mục ựắch ựể khử hết nước và khử hết cồn ra khỏi tổ chức.
Yêu cầu: Khi nào miếng tổ chức trong như cục thạch là ựược. Nếu quá lâu thì miếng tổ chức sẽ dòn và dễ vỡ và khó cắt.
- Khử xylen: Cho qua hệ thống paraffin ựã ổn ựịnh (parafin có từ 3 Ờ 5% sáp ong ựã nấu, ựảo nhiều lần thành một môi trường ựồng nhất, ổn ựịnh, ựặc, chắc, không lẫn tạp chất). Gồm 3 lọ:
Paraffin I : 6 giờ (560C). Paraffin II : 6 giờ (560C). Paraffin III: 12 giờ (560C).
Mục ựắch: để khử hết xylen trong tổ chức, trong tổ chức chỉ còn paraffin thấm ựều trong các kẽ mô bào.
+ đúc block: (để vùi miếng tổ chức trong môi trường paraffin thuần
nhất tạo thành một thể thống nhất). Phương pháp tiến hành:
- Tháo bệnh phẩm ra khỏi dây xâu, ựặt vào ngăn chứa paraffin lỏng. - đổ paraffin lỏng vào khuôn, dùng kẹp hơ nóng nhúng nhanh vào ngăn chứa bệnh phẩm, gắn miếng bệnh phẩm ựặt vào chắnh giữa khuôn, ựể miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn.
- đặt khuôn ựã ựúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. để nguội từ từ ựến khi ựông cứng, ựặc chắc là ựược.
- Bóc khuôn, chỉnh sửa block cho vuông vắn rồi gắn nhãn, tránh nhầm lẫn.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 26 Chuẩn bị: Cắt bằng máy Microtom với ựộ dàn mảnh cắt khoảng 3 - 5 ộm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức là ựược.
- Lau chùi các phiến kắnh thật cẩn thận: phiến kắnh trong và sáng, không xước, sạch sẽ.
- Chuẩn bị nước trứng: Lấy lòng trắng trứng, cho glyxerin vào với khối lượng tương ựương với lòng trắng trứng. Dùng ựũa hay bi thủy tinh ựánh thật mạnh. Cho một hạt thymol tinh thể, chống thối rữa. Lọc bằng giấy lọc có nếp gấp.
- Khi lấy nước trứng ra ựể dùng ta pha ra nước cất 25ml cộng dung dịch albumim có glyxerin 9 giọt, rồi khuấy cho tan cho ựều.
- Tãi mảnh và dán: Sau khi cắt ựược, lấy một phiến kắnh trong sáng, không xước, sạch. Nhỏ 4 Ờ 5 giọt nước trứng ựã pha lên trên phiến kắnh.
- đặt mảnh cắt sao cho nổi lên mặt nước trứng (không ựược nhỏ dung dịch nước trứng lên trên mảnh cắt, sẽ dây vết khi nhuộm).
- Miết phiến kắnh trên bàn nóng và theo dõi mảnh cắt tãi ra, mảnh cắt phải nổi trên dung dịch, bàn nóng không ựược nóng quá 500C nếu không tổ chức sẽ bị khô ựét. Khi thấy mảnh cắt duỗi thẳng ra, không bị rữa, không bị rách, chảy ra là ựược.
- để khô tiêu bản theo tư thế nghiêng, ắt nhất là 12 giờ ở nhiệt ựộ bình thường hoặc 20 Ờ 30 phút trong tủ ấm (370C), khi ựã khô kiệt các mảnh cắt dắnh rất tốt vào phiến kắnh là có thể ựem nhuộm ựược.
+Nhuộm tiêu bản:
- Các bước tiến hành:
Nhuộm tiêu bản theo phương pháp nhuộm kép bằng thuốc nhuộm Hematoxylin Ờ Eosin. Các bước nhuộm như sau:
→Bước 1: Khử paraffin: Cho qua hệ thống 3 lọ xylen.
Xylen I: 3-5 phút → Xylen II: 3-5 phút → Xylen III: 3-5 phút. Sau ựó phải lau hết phần xylen quanh tiêu bản rồi chuyển sang cồn.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 27
→ Bước 2: Khử Xylen:
Cho tiêu bản qua hệ thống gồm hai lọ gồm 3 lọ cồn ethylic.
Cồn I (1000I): 5 phút →Cồn II (1000I): 5 phút →Cồn III (1000I): 5 phút
→ Bước 3: Khử cồn: để tiêu bản dưới vòi nước chảy trong 15 phút. → Bước 4: Nhuộm Hematoxylin (nhuộm nhân)
Sau khi ựã rửa tiêu bản qua nước chảy trong vòng 10 phút ta ựem lau khô nước xung quanh tiêu bản, ựặt tiêu bản lên trên giá ựể rồi nhỏ Hematoxylin ngập tiêu bản, ựể trong vòng 20 giây. Sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi, cho rửa nước chảy trong vòng 10 phút cho hết Hematoxylin thừa. đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vảy khô ựi. Kiểm tra màu sắc, nếu tiêu bản có màu xanh tắm là ựược.
Nếu nhạt màu thì nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây).
Nếu màu ựậm quá thì nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 900 + HCl, tỷ lệ HCl là 1%) trong 30 giây. Sau khi ựiều chỉnh màu ta rửa sạch tiêu bản bằng nước cất.
→Bước 5: Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản 20 giây tùy theo thực tế màu Eosin. Sau ựó rửa nước chảy 10 phút cho hết Eosin thừa. Sau khi rửa nước ta lau sạch phần nước xung quanh bệnh phẩm.
→ Bước 6: Tẩy nước: Ta cho tiêu bản qua hệ thống 3 lọ cồn
Cồn 900I: 15 giây →Cồn 1000I: 15 giây →Cồn 1000I: 15 giây.
→ Bước 7: Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản qua xylen I. Rồi
sang xylen II, ta lau sạch cồn ở xung quanh lam kắnh rối chuyển sang xylen III, sau ựó cho vào xylen IV rồi cho vào tủ ấm 370C trong vòng 2 phút.
+ Bước 8: Gắn Baume canada.
- Tiến hành: Nhỏ một giọt Baume canada, xylen ấm lên trên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen ấm lên trên tiêu bản. Ấn nhẹ ựể dồn hết bọt khắ ra ngoài.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
- đánh giá: đem soi kắnh hiển vi quang học ở vật kắnh 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tắm, bào tương bắt màu ựỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.