Phương pháp tăng sinh.
Nấm men dùng trong thí nghiệm ở dạng tiềm sinh trên môi trường thạch, muốn dùng để lên men thì phải tăng sinh (nhân giống) để số lượng tế bào nấm men tăng lên đủ để lên men.
+ Trước tiên phải vô trùng dụng cụ tăng sinh ở tủ sấy tiệt trùng. Dụng cụ phải được rửa sạch và tiến hành bao gói sấy vô trùng ở 1600C trong 2 giờ (dụng cụ là bình tam giác và pipet để lấy mẫu).
+ Tiến hành hấp khử trùng dịch tăng sinh ở 1000C trong vòng 15 phút .
Dịch tăng sinh là dịch quả hổn hợp giữa táo và chuối sau khi ép. Sau đó điều chỉnh độ đường khoảng 12 - 14 độ Brix , pH 3,2 – 3,5, sau đó thêm một lượng vitamin B1 và amon sunfat.
+ Để nguội dịch tăng sinh, sau đó tiến hành cấy nấm men trong điều kiện vô trùng. + Sau đó nhân giống ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 – 36 h, sục khí oxy liên tục trong quá trình nhân giống để đảm bảo quá trình sinh trưởng và phát triên của nấm men. + Trong quá trình nuôi cấy nấm men ta đếm nấm men trong các khoảng thời gian 0; 4; 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36 giờ đọc kết quả và vẽ đồ thị. Chọn ra thời gian nuôi cấy nấm men thích hợp nhất trước khi đem đi lên men.
Đếm số lượng tế bào nấm men bằng buồng đếm Thomas.
+ Buồng đếm Thomas có tất cả 25 ô lớn, trong mỗi ô lớn lại 16 ô nhỏ, diện tích mỗi ô nhỏ là 1/400 m2.
+ Chuẩn bị mẫu:
- Pha loãng mẫu nấm men tới 102, lau lá kính thật sạch bằng 1 miếng bông thấm nước có tẩm cồn.
- Lấy 1 miếng bông có thấm nước chùi sơ 2 khe của buồng đếm, để phiến kính dễ dính.
- Cho 1 ít dịch tế bào lên lá kính, đậy lá kính lên giữa 2 khe trên buồng đếm, sao cho không có khí ở khu vực buồng đếm, lấy bông thấm dịch hoặc nước 2 bên buồng đếm nếu có.
- Đưa buồng đếm đặt lên khay kính hiển vi, quan sát ở vật kính x40, chỉnh vi ốc và ánh sáng để thấy rõ.
- Tế bào nấm men hiện lên trong buồng đếm hình cầu trong, sáng có màng tế bào bao quanh, nguyên sinh chất trong suốt. Có tế bào riêng biệt, có tế bào đang nảy chồi đang còn dính với nhau.
- Đếm tế bào ở ô theo 2 đường chéo của buồng đếm hình vuông.
- Quan sát ở vật kính x40 thì một ô lớn chiếm hầu hết diện tích vi trường nên rất khó xác định ô đếm, ta phải xác định ô đầu tiên là 1 trong 4 ô ở các góc, sau đó mới đi xác định các ô tiếp theo kề nó.
X X
X
X X
Đếm số lượng nấm men ở 5 ô lớn tương ứng với 80 ô nhỏ (1 ô giữa và 4 ô xung quanh) trong buồng đếm sau đó chia trung bình. Kết quả sau khi đếm được tính như sau:
X = *1000 025 , 0 *F A (tb/ml)
Trong đó X: số tế bào nấm men trong 1ml dịch ( tb/ml ) F : hệ số pha loãng.
A: trung bình số tế bào đếm được.
0,025 * 103 : Thể tích một ô lớn buồng đếm.
Hì