tắch cần lau là 10cm2. Sau ựó lấy các ựầu tăm bông, cho vào bình tam giác chứa 100ml nước sinh lý 0.85%, ựồng nhất thu ựược dung dịch huyền phù ban ựầu. Tiếp tục pha loãng mẫu theo bậc pha loãng thập phân (10-2, 10-4...).
- Phương pháp kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khắ trên bề mặt nền, sàn và phản pha lọc thịt: TCVN 5667: 1992.
- Phương pháp kiểm tra Coliforms tổng số trên bề mặt nền, sàn và
phản lọc thịt: TCVN 4882: 2001.
2.3.3. Phương pháp kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật trong nước sử dụng cho các ựiểm giết mổ lợn. cho các ựiểm giết mổ lợn.
2.3.3.1 Chuẩn bị và lấy mẫu
Tiến hành lấy mẫu theo ỘThường quy kỹ thuật y học lao ựộng và vệ sinh môi trườngỢ của Viện y học lao ựộng và vệ sinh môi trường, Hà Nội 1993. được mô tả tóm tắt như sau:
- Mẫu nước ựược lấy trong các bể chứa tại các ựiểm giết mổ hoặc hứng trực tiếp từ vòi. Dụng cụ lấy là chai thủy tinh nút mài ựã ựược tiệt
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 29
trùng. Trước khi lấy mẫu cần ghi rõ nhãn mác, ựịa ựiểm và thời gian lấy mẫu. Mẫu sẽ không ựược phân tắch nếu không rõ nguồn gốc.
- Mẫu ựược bảo quản trong phắch ựá, hộp lạnh nếu không thể vận chuyển mẫu về phòng thắ nghiệm trong vòng 2 giờ.
2.3.3.2 Phương pháp kiểm tra một số vi sinh vật chi ựiểm trong nước sử dụng cho giết mổ
a) Phương pháp xác ựịnh TSVKHK trong 1ml nước
+ Lấy mẫu: (giống mục 3.3.4.1)
+ Sử dụng phương pháp xét nghiệm vi khuẩn nguồn nước theo quy trình của Viện Y Học Lao động và Vệ Sinh Môi Trường (2002) và TCVN 2680-78 quy ựịnh về nước sử dụng cho cơ sở giết mổ.
+ Pha loãng mẫu: Pha loãng mẫu theo bậc thập phân, chuẩn bị một dãy
ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước sinh lý vô trùng, ựánh số thứ tự 1,2,3... Hút 1ml nước mẫu cho vào ống nghiệm thứ nhất, trộn ựều, ta ựược ựộ pha loãng 10-1. Dùng pipet vô trùng hút 1ml ở ống nghiệm 1 ựưa sang ống 2, trộn ựều ựược dung dịch 2 pha loãng 10-2... Tiến hành tương tự ta ựược các dung dịch với ựậm ựộ 10-3, 10-4... (chú ý mỗi ựậm ựộ pha loãng dùng một ựầu pipet tiệt trùng riêng ).
+ Cấy mẫu: sử dụng phương pháp cấy láng. Với mỗi mẫu nước kiểm nghiệm cần nuôi cấy trên 3 ựậm ựộ liên tiếp, mỗi ựậm ựộ trên 2 ựĩa thạch.
Dùng micro pipet hút 0,1ml huyễn dịch ở các ựậm ựộ khác nhau cấy vào ựĩa petri có chứa thạch PCA. Xoay nhẹ ựĩa theo chiều kim ựồng hồ và ngược lại, dùng que cấy láng dàn ựều huyễn dịch nuôi cấy trên mặt thạch. đánh dấu số mẫu, ựộ pha loãng, bao gói và cho vào tủ ấm ựã ựiều chỉnh nhiệt ựộ 370C, sau 24h ựem ra ựọc kết quả.
+ đọc kết quả: Chọn tất cả các ựĩa thạch có từ 15 - 300 khuẩn lạc ựể tắnh kết quả. Sự phân bố khuẩn lạc trên ựĩa thạch nuôi cấy ở các ựậm ựộ khác
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 30
nhau phải hợp lý. Kết quả ựược tắnh toán theo công thức (II).
d n n V C ml CFU X ) 1 , 0 ( ) / ( 2 1+ = ∑ (II) Trong ựó:
+ ∑C: tổng số khuẩn lạc ựếm ựược trên các ựĩa ở 2 ựộ pha loãng liên tiếp nhau.
+ V: Thể tắch mẫu (ml) cấy vào môi trường.
+ n1, n2: số ựĩa ở 2 ựậm ựộ pha loãng liên tiếp ựã chọn. + d: Hệ số pha loãng của ựậm ựộ pha loãng ựã chọn thứ nhất. + C.F.U (Colonies Forming Units ): số ựơn vị khuẩn lạc. b) Phương pháp xác ựịnh Coliforms và E.coli
Nguyên tắc: Mẫu ựược pha loãng theo hệ số thập phân, ủ trong ống chứa môi
trường thắch hợp có ống Durham. Mỗi nồng ựộ pha loãng ựược ủ trong 3 ống môi trường. Xác ựịnh ống dương tắnh thông qua theo dõi sự sinh hơi và ựổi màu của từng ống. Ghi nhận các ống dương tắnh ở mỗi nồng ựộ pha loãng, tra bảng MPN ựể tắnh số lượng vi sinh vật có trong 1g hay 1ml mẫu ban ựầu.
Ớ Xác ựịnh Coliforms
Tiến hành:
+ Lấy mẫu: (giống mục 3.3.4.1).
+ Từ mỗi nồng ựộ pha loãng cấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường LTS (Lactose TriptoneSulphatlauryl Broth ), mỗi mẫu ắt nhất phải nuôi cấy ắt nhất trên 3 nồng ựộ pha loãng, ở ựây chúng tôi cấy 3 nồng ựộ 10-2, 10-3, 10-4, cấy 1ml vào mỗi ống. để vào tủ ấm 37oC, sau 48 giờ ựọc kết quả.
Ớ Xác ựịnh E.coli
+ Lấy mẫu và pha loãng mẫu giống như mô tả ở mục 3.3.4.1.
+ Cấy và ủ trong môi trường canh thang Brilliant Green: Sử dụng phương pháp 9 ống, mỗi ống có 10 ml môi trường và 1 ống Durham. Chọn 3 ựộ pha loãng liên tiếp, mỗi ựộ pha loãng cấy 1ml vào 3 ống môi trường. Lắc nhẹ ống
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 31
môi trường ựể ống Durham chìm xuống, không có bọt khắ trong ống Durham. đem toàn bộ 9 ống ủ ở 37oC trong vòng 48 giờ, sau ựó lấy ra ựọc kết quả: Ống dương tắnh là những ống có sinh hơi, ống Durham nổi lên, môi trường chuyển từ màu xanh sang màu vàng nhạt.
+ Cấy chuyển và ủ vào môi trường chọn lọc canh thang EC: Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống BGBL (+) sang các ống canh EC ủ ở 44,50C. đếm các ống cho kết quả (+). Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường thạch ựĩa EMB. Ủ các ựĩa này ở 370C/24h ựể tìm các khuẩn lạc tròn, dẹt, có ánh kim tắm.
+ Tiến hành thử nghiệm khẳng ựịnh E.coli.
để khẳng ựịnh chắnh xác E.coli, ta tiến hành các thao tác sau: Cấy chuyển lên môi trường T.S.I, thử phản ứng sinh hóa trên dãy phản ứng IMViC.
Kết quả xác ựịnh là E.coli nếu:
+ Môi trường T.S.I chuyển sang màu vàng cả phần mặt ựáy và mặt nghiêng, vi khuẩn có sinh hơi, không sinh H2S.
+ Dãy phản ứng IMViC cho kết quả (+ + - -).
+ Ống nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC và IMViC như trên là ống E.coli (+). Thực hiện tương tự cho tất cả các ống nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC và tạo ựược khuẩn lạc E.coli giả ựịnh trên môi trường EMB. Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E.coli (+) ở mỗi ựộ pha loãng của mẫu.
đọc kết quả:
Ở tất cả các trường hợp trên, từ số lượng các ống nghiệm E.coli (+) ở
mỗi ựộ pha loãng của mẫu dùng bảng MPN thắch hợp (bảng 3x3 tức 9 ống nghiệm) ựể tắnh ra mật ựộ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban ựầu chưa pha loãng.
Xác ựịnh số ống dương tắnh ở mỗi ựộ pha loãng, từ ựó tra bảng MPN thắch hợp, tắnh kết quả theo công thức sau:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 32
MPN/g hay MPN/ml = (MPN/g hay ml trong bảng : 100)x số lần pha loãng mẫu của nồng ựộ ở giữa.
c) Phương pháp xác ựịnh vi khuẩn Salmonella (theo ISO:6579-2002)
Phương pháp xác ựịnh sự có mặt của vi khuẩn Salmonella ựược thực hiện theo qui trình sau:
Pha loãng mẫu theo bậc pha loãng thập phân: 10-1, 10-2,Ầ10-4 ↓
Tăng sinh chọn lọc:
Cấy 1ml dung dịch pha loãng mẫu nồng ựộ 10-1
sang 10ml môi trường tăng sinh Muller Kauffman, ủ ở 370C/24h ↓
Phân lập và nhận diện: Cấy 0,1ml dịch tăng sinh
trên 2 môi trường chọn lọc XLT4 và BGA, ủ ở 370C/24h + Trên môi trường XLT4: Khuẩn lạc ựen bóng, rìa gọn
+ Trên môi trường BGA: Khuẩn lạc màu hồng sáng
↓
Khẳng ựịnh bằng cách thử ựặc tắnh sinh hóa:
- Cấy chuyển sang môi trường TSI: phần thạch nghiêng màu ựỏ, thạch ựứng màu vàng, sinh H2S, sinh hơi
- Thử nghiệm IMVC cho kết quả (- + - +) ↓
Kết luận: Phát hiện hay không phát hiện Salmonella
2.3.4. Phương pháp kiểm tra một số vi khuẩn chỉựiểm trên thân thịt lợn lấy tại cơ sở giết mổ tại cơ sở giết mổ
2.3.4.1 Chuẩn bị và lấy mẫu
Lấy mẫu theo QCVN 01- 04:2009/BNNPTNT
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 33
hộ, tăm bông vô trùng. Khuôn lấy mẫu vô trùng, kắch thước 10cmx10cm. Ống nghiệm chứa dung dịch peptone. Thùng xốp chứa ựá.