Tiến hành xác định nucleotide của gen LTP ở hai mẫu nghiên cứu VC1973A và D15 trên máy xác định trình tự tự động, kết quả xác định trình tự được xử lý trên phần mềm DNAstar và BioEdit.
Kết quả phân tích trình tự gen của hai mẫu nghiên cứu (dòng D15 và VC1973A), đoạn gen tách dòng có kích thước đúng với dự tính, cho thấy chiều dài của gen LTP của hai mẫu nghiên cứu có kích thước 351 nucleotide. Như vậy, chúng tôi đã tách dòng và xác định được trình tự gen LTP của dòng D15 và VC1973A (Hình 3.10).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.10. Trình tự nucleoitde của gen LTP hai mẫu đậu xanh D15 và VC1973A
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.7. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen LTP ở các dòng đậu
xanh nghiên cứu
Dựa vào hình 3.10, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự gen của hai mẫu đậu xanh nghiên cứu. Kết quả cho thấy có 4 vị trí sai khác giữa giống gốc VC1973A và dòng D15 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước (Bảng 3.5).
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy sự sai khác về nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh VC1973A và dòng D15 thể hiện lần lượt ở các vị trí 1, 3 , 349, 350. Với các nucleotide sai khác ở VC1973A (T, G, A, G), dòng D15 (C, T, C, T). Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide của giống gốc VC1973A và D15 đạt 98,9%
Bảng 3.5. Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen LTP ở VC1973A và D15 STT Vị trí VC1973A D15
1 1 T C
2 3 G T
3 349 A C
4 350 G T
Từ kết quả xác định trình tự ở trên, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự gen của LTP của hai mẫu đậu xanh giống VC1973A và dòng D15 với các trình tự gen đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế (GenBank) với các mã số sau: AY300807, FM200034, HE589494, kết quả được thể hiện ở hình 3.11.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.11. Trình tự nucleotide của gen LTP hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15 với các trình tự đã công bố
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nucleotide Substitutions (x100) 0 1.0 D15.seq VC1973A.seq AY300807.seq HE589494.s eq FM200034.seq
Hình 3.11 cho thấy trình tự nucleotide của hai mẫu nghiên cứu VC1973A và D15 đều có hệ tương đồng với trình tự nucleotide của các gen đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế từ 97,4% đến 99,7%. Sự sai khác trong trình tự nucleotide bao gồm 10 vị trí được thể hiện ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Vị trí sai khác trình tự nuclotide của gen LTP hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15 với các trình tự đã công bố trên GenBank STT Vị trí AY300807 FM200034 HE589494 VC1973A D15
1 1 A A A T C 2 3 G G G G T 3 276 T A T T T 4 302 A T A A A 5 313 A T A A A 6 314 A G A A A 7 326 T T C T T 8 349 T T T A C 9 350 A A A G T 10 351 A A A T T
Trên cơ sở xác định trình tự nucleotide của hai mẫu đậu xanh nghiên cứu và so sánh với các trình tự nucleotide công bố trên Genbank xây dựng được cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm chuyên dụng (Hình 3.12)
Hình 3.12. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ giữa các trình tự gen LTP của các mẫu đậu xanh nghiên cứu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sơ đồ hình cây ở hình 3.12 cho thấy các trình tự gen so sánh được chia làm hai nhánh chính là: nhánh gen được công bố trên Genbank mã số FM200034 và nhánh còn lại gồm các gen công bố trên Genbank mã số AY300807, HE589494, D15, VC1973A. Hai mẫu trình tự VC1973A và D15 nằm trong nhánh nhỏ cùng với trình tự có mã số AY300807. Như vậy, hai trình tự mẫu đậu xanh nghiên cứu có quan hệ gần gũi với nhau và cũng có quan hệ gần gũi với các trình tự được công bố trên Genbank.
3.3.8. Kết quả so sánh trình tự amino acid của gen LTP ở các dòng đậu xanh nghiên cứu
Sử dụng phần mềm BioEdit dịch mã giả thuyết đoạn gen của hai mẫu đậu xanh nghiên cứu sang protein kết quả thu được 117 amino acid (Hình 3.13). Khi so sánh tổng hợp các vị trí tổng hợp amino acidcủa hai mẫu đậu xanh nghiên cứu nhận thấy rằng chỉ có duy nhất một vị trí amino acid thay đổi là vị trí 117. VC1973A vị trí 117 là S , dòng D15 vị trí 117 là L. Hai trình tự amino acid đạt mức độ tương đồng 99,1%.
Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid của gen LTP hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15
Chúng tôi tiếp tục tiến hành so sánh trình tự amino acid của hai mẫu đậu xanh nghiên cứu với các trình tự của các gen đã công bố trên Genbank (Hình 3.14)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.14. So sánh trình tự amino acid của gen LTP hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15 so với các mẫu trên Genbank
Kết quả phân tích hình 3.14 cho thấy trình tự amino acid của hai mẫu đậu xanh nghiên cứu có sự sai khác với 3 trình tự công bố trên Genbank lần lượt ở vị trí 1 và 117. Với trình tự amino acid mã số FM200034 sai khác ở vị trí 101, 105. Mã số HE589494 vị trí sai khác là 109.
Bảng 3.7. Vị trí sai khác amino acid của gen LTP hai mẫu đậu xanh VC1973A, D15 với các trình tự đã công bố trên Genbank
STT Vị trí AY300807 FM200034 HE589494 VC1973A D15
1 1 M M M L L
2 101 N I N N N
3 105 K W W W W
4 109 F F S F F
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN
1.1. Các tính trạng: chiều cao cây, số cành/ cây, chiều dài quả, số lượng quả, số hạt/quả, khối lượng 1000 hạt ở thế hệ R2 và R3 có xu hướng dần ổn định. Đã chọn được hai dòng có triển vọng là D15 và D40 dựa trên một số đặc điểm nông sinh học.
1.2. Hàm lượng protein của các dòng dao động từ 22,96%- 24,78%, hàm lượng lipit dao động từ 0,53 %- 0,74 %.
1.3. Đã nhân bản, tách dòng và xác định trình tự gen LTP của dòng đậu xanh D15 và giống gốc VC1973A. Kích thước của gen LTP của hai mẫu nghiên cứu là 351 nucleotide, mã hóa cho 117 amino acid.
1.4. Xác định được bốn vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen LTP và một vị trí sai khác trong trình tự amino acid do gen LTP mã hoá ở dòng đậu xanh D15 và giống gốc VC1973A.
1.5. So sánh với các trình tự gen LTP của dòng D15 và giống gốc VC1973A với các trình tự LTP đã công bố trên Genbank đã xác định được 10 vị trí sai khác về trình tự nucleotide và 5 vị trí sai khác trình tự amino acid.
2. ĐỀ NGHỊ
2.1. Cần tiếp tục trồng và theo dõi sự ổn định, đánh giá khả năng chịu hạn của dòng D15 và D40 để giới thiệu khảo nghiệm giống.
2.2. Tiếp tục nghiên cứu gen LTP của các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước để đánh giá khả năng chịu hạn của đậu xanh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Trần Bình và cs (1998), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến
giống cây trồng, NXB Nông nghiệp.
2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu
ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội.
3. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực
hành Hoá sinh học, NXB Giáo dục.
4. Nguyễn Mạnh Chính, Nguyễn Mạnh Cường (2008), Trồng đậu xanh, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội : 3-9.
5. Đường Hồng Dật (2006), Cây đậu xanh. Kỹ thuật thâm canh và biện pháp
tăng năng suất, chất lượng sản phẩm, NXB Lao Động - Xã Hội, tr: 5-3
6. Điêu Thị Mai Hoa, Lê Trần Bình (2005), „„ Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 57 giống đậu xanh (Vigna radiata L.) bằng kỹ thuật RAPD‟‟,
Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(1): 57-66.
7. Nguyễn Đăng Khôi (1997), “Các cây đậu ăn hạt ở Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, số 2, : 5-6.
8. Kết quả nghiên cứu khoa học đậu đỗ 1991- 1995 (1996), Viện Khoa học kỹ
thuật Nông nghiệp, Việt Nam : 4-188.
9.Kết quả nghiên cứu khoa học nông nghiệp 2000 (2001), NXB Nông Nghiệp.
10. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hoá sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở
Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
11. Trần Đình Long, Lê Khả Tường (1991), Những nghiên cứu mới về chọn
tạo giống đậu đỗ, NXB Nông nghiệp, Hà Nội : 2-20.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
13. Đỗ Tất Lợi (1997), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
14. Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội : 20-215.
15. Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo các dòng đậu tương và đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc
Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
16. Chu Hoàng Mậu, Ngô Thị Liêm, Nguyễn Thị Tâm (2006), “ Đánh giá khả
năng chịu hạn của một số giống lạc bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro”, Hội
nghị khoa học và công nghệ toàn quốc (2006), NXB KH &KT: 202- 209 17. Chu Hoàng Mậu, Lê Trần Bình (2001), “Hàm lượng amino acid trong hạt
của các dòng đậu tương và đậu xanh đột biến”, Tạp chí Sinh học, 23(4). 18. Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong
chọngiống cây trồng, NXB Đại học Thái Nguyên
19. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2006), Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử
ở một số giống đậu xanh chịu hạn, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu
khoa học và công nghệ cấp Bộ.
20. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền và phân lập một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu xanh
(Vigna radiata (L.) Wilczeck), Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ
Sinh học, Hà Nội.
21. Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng
chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh
học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà nội.
22. Nguyễn Thị Vinh, Lê Duy Thành, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1995),
“Nghiên cứu khả năng chịu nhôm và acid của các giống lúa DDC3,
CM10, Pokaly, Cườm, Chiêm Bầu, C202, NN08, OM861 – 20, OM296
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tài liệu tiếng Anh
23. Arondel V., Vergnolle C., Cantrel C., Kader J.C. (2000), “Lipid transfer protein are encoded by a small multigen familly in Arabidopsis
thaniana”, Plant Science, 157 : 1-12.
24. Blein J.P., Coutos P.T., Marion D., Ponchet M. (2002), “From elicitins to lipid-transfer proteins: a new insight in cell signalling involved in plant defence mechanisms”, Trends in Plant Science, 7 : 293-296.
25. Blilou I., Ocampo J.A., Garcia – Garrido J.M. (2005), „„ Induction of LTP and Pal gene expression in rice roots clonized by the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mosseae‟‟, www.ncbi.nlm.nih.gov.
26. Bourgis F., Kader J.C. (1997), “Lipid-transfer proteins: Tools for manipulating membrane lipids”, Physiologia Plantarum Volume 100, Number 1 : 78-84.
27. Carvalho A.O., Souza-Filho G.A., Ferreira B.S., Branco A.T., Araujo I.S., Fernandes K.V., Retamal C.A., Gomes V.M. (2006), „„Cloning and characterization of a cowpea seed lipid transfer protein cDNA: expression analysis during seed development and under fungal and cold stresses in seedling tissues‟‟, Plant Physiol Biochem, 44(11-12) : 732-742.
28. Carvalho A.O., Tavares O.L.M., Santos I.S., Cunha M., Gomes V.M. (2001), “Antimicrobial peptides and imunolocatization of a LTP in Vigna
radiata seeds‟‟, Plant physiol Biochem, 39 : 137-146.
29. Douliez J.P., Michon T., Elmorjani K. and Marion D. (2000), “Structure, Biological and Technological Functions of Lipid Transfer Proteins and Indolines, the Major Lipid Binding Proteins from Cereal Kernels”,
Journal of Cereal Science, Volume 32, Issue 1 : 1-20.
30. Gawel N.J., Jarret R.H. (1991), Genomic DNA isolation
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
32. Guerbette F., Grosbois M., Jolliot C.A., Kader J.C. and Zachowski A. (1999), “Lipid-transfer proteins from plants: Structure and binding properties”, Molecular and Cellular Biochemistry, 192 : 157-161.
33. Kader J.C. (1996), “Lipid-transfer proteins in plants”, Annual Review of
Plant Physiology Plant Molecular Biology , 47 : 627-654.
34. Karen S. and John M. (1990), “Gene expression in respone to abscisic acid and osmotic stress”, The plant cell, 2 : 503-512.
36. Kang S.J., Kim M.C., Yoo D.W., Park K.S. (2002), Vigna rariata cystatin mRNA, complete cds, EMBL GenBank, Accession AF454396.
35. Kimberly D.C., Mark A.T. and Lawrence B.M. (2005), „„Increased Accumulation of Cuticular Wax and Expresion of Lipid Transfer Protein in Response to Periodic Drying Events in Leaves of Tree Tobacco‟‟,
www.ncbi.nlm.nih.gov.
36. Liu K.H., Lin T.Y. (2003), “Cloning and characterization of two novel lipid transfer protein I genes in Vigna radiate”, DNA sequence – The
Journal of sequencing and mapping, 14(6) : 420-426.
37. Masuta C., Furuno M., Tanaka H., Yamada M., Koiwai A. (2005), „„Molecular cloning of a cDNA clone for tobacco lipid transfer protein and expression of the functional protein in Escherichia‟‟,
www.ncbi.nlm.nih.gov.
38. Molina A., Garcia O.F. (1993), “Developmental and pathogen-induced expression of three barley genes encoding lipid transfer proteins”, The
Plant Journal, 4 : 983-991.
39. Molina A., Diaz I., Vasil I.K., Carbonero P., Garcisa O.F. (1996), “Two cold-inducible genes encoding lipid transfer protein LTP4 from barley show differential responses to bacterial pathogens”, Molercular and
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
40. Park C.J., Shin R., Park J.M., Lee G.J., You J.S. and Paek K.H. (2002), “Induction of pepper cDNA encoding a lipid transfer protein during the resistance response to tobacco mosaic virus”, Plant Molecular Biology, Volume 48, Number 3 : 243-254
41. Pe M. E. (1993), “Mapping quantitative trait loci (QTLs) for resistance to gibberella zeae infection in maize”, Molercular
Gene Geneet, 241(1-2) : 11-16.
42. Terras F.R., Schoofs H.M., De Bolle M.F. (1992), “Analysis of two novel classes of plant antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds”, The Journal of Biological Chemistry, 287(22): 15301-9.
43. Terres S.S., Godoy J.A., Pintor-Toro J.A. (1992), „„A probable lipid transfer protein is induced by NaCl in stems of tomato plants‟‟, Plants
Molecular Biology, 105 : 749-756.
44. Verma D.P.S. (1990), “Genetic engineering for prolin biosynthesis and the role prolin in salt stress and symbiotic nitrogene fixation”, In: Proccedings of the international symposium on molecular and genetic
approaches to plant stres, Newdelhi : 14-17.
45. Vignols F. Lund G., Pammi S., Tremousaygue D., Grellet F., Kader J.C., Puigdomenech P., Delseny M. (1994), “ Characterizarion of a rice gene coding for a lipid transfer protein”, Gene, 142 : 420-426
46. Zhencai W. and Jacqueline K. B. (2003), “Isolation and characterization of a cDNA encoding a lipid transfer protein expressed in Valencia orange during abscission”, Journal of Experimental Botany, 54( 385) : 1183-91.
47. Xiong L., Karen S. S., Zhu J. K. (2002), "Abiotic stress signal transduction in plants: Molecular and genetic perspetives", Physiologica Plantarum, 112: 152-166.