3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA tổng số là bước khởi đầu cho mọi nghiên cứu sinh học phân tử. Tiến hành tách chiết DNA tổng số từ hệ gen của giống gốc VC1973A và dòng D15 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước theo phương pháp của Gawel và Jarret (1991). DNA tổng số được kiểm tra chất lượng bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X, nhuộm bản gel bằng ethydium bromide, soi dưới ánh đèn cực tím và chụp ảnh (Hình 3.4). Tiếp theo chúng tôi tiến hành kiểm tra hàm lượng và chất lượng DNA tổng số đã tách chiết được bằng phương pháp quang phổ hấp thụ, kết quả thu được hàm lượng DNA tổng số của dòng đậu xanh D15 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước và giống gốc dao động từ 245,6- 935 (mg/ml), tỷ lệ OD260/OD280 dao động từ 1,80 – 1,94. Như vậy, DNA tổng số thu được đảm bảo chất lượng cho các thao tác và phân tích DNA của đối tượng nghiên cứu.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di DNA tổng số tách chiết từ mô lá của giống đậu xanh VC1973A và dòng D15 (M. Maker; 1. VC1973A; 2. D15)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.2. Kết quả nhân gen LTP từ hệ gen của dòng D15 và giống gốc
Chúng tôi tiến hành nhân bản gen LTP có kích thước của gen ước tính khoảng 350bp bằng kỹ thuật PCR từ DNA hệ gen với cặp mồi có trình tự thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Trình tự mồi nhân gen LTP
Tên mồi Trình tự nucleotide Nhiệt độ gắn mồi
LTPF 5‟ GATTGTTAGCGCAGTTGGTGAAG 3‟ 520C
LTPR 5‟ GGCTAGCCTGAAGGTTGCATG 3‟ 520C
Kết quả nhân gen được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím (Hình 3.5).
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kết quả nhân gen LTP
(M. Marker 1kb; 1. VC1973A; 2. D15)
Hình 3.5 cho thấy đoạn gen LTP nhân được có kích thước 350bp và có hàm lượng đủ lớn để thực hiện tách dòng. Độ dài đoạn DNA thu được có kích thước phù hợp với kết quả tính toán lý thuyết.
350bp 500bp
250bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tiến hành tinh sạch (thôi gel) sản phẩm đoạn gen LTP bằng bộ kit của Hãng Bioneer (AccuPrep PCR Purification Kit). Kết quả điện di cho thấy sản phẩm sau khi được tinh sạch đảm bảo yêu cầu về hàm lượng và chất lượng.
3.3.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Sản phẩm thôi gel của 2 mẫu D15 và VC1973A đạt yêu cầu sẽ được gắn vào vector tách dòng pBT nhờ enzyme nối T4 ligase. Phản ứng ghép nối dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa hai đầu nucleotide A thò ra ở sản phẩm PCR với Taq - polymerase và hai đầu nucleotide T trên vector tách dòng pBT. Hỗn hợp được ủ ở 220
C trong 1 giờ cho phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α và được cấy trải trên môi trường LB đặc (cao nấm men, Bacto Tryptime, NaCl, bacto Aga technical) có bổ sung kháng sinh Carbe (20mg/l), X-gal (20mg/l) và IPTG (20µM). Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ. Kết quả thu được có cả khuẩn lạc màu xanh và màu trắng được thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. Hình ảnh khuẩn lạc
Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vecto pBT hoạt động bình thường, không có đoạn gen lạ nào chèn vào, khi có chất cảm ứng IPTG bổ sung vào sẽ tổng hợp enzyme chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Những khuẩn lạc màu trắng có thể đã nhận được đoạn gen lạ chèn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
vào, nên không hoạt động, khi bổ sung chất cảm ứng IPTG thì gen không tổng hợp enzyme chuyển hóa cơ chất X-gal. Các khuẩn lạc màu trắng mang plasmid tái tổ hợp sẽ được chọn lọc bằng phương pháp colony- PCR
3.3.4. Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang vecto tái tổ hợp
Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng PCR với cặp mồi LTPF/LTPR để xác định khuẩn lạc có mang gen mong muốn. Sản phẩm colony -PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím (Hình 3.7).
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR
(M. Marker 1kb; 1. VC1973A; 2. D15)
Từ kết quả điện di ở hình 3.7 cho thấy sản phẩm colony-PCR từ những khuẩn lạc màu trắng đều cho kết quả một băng duy nhất đúng kích thước 350bp của gen LTP. Điều này đã khẳng định kết quả biến nạp và chọn dòng đã được thực hiện thành công.
3.3.5. Kết quả tách và kiểm tra plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu
Nuôi khuẩn lạc trắng mang gen LTP đã được chọn bằng colony- PCR. Lấy 2 µl môi trường LB lỏng, tế bào được thu bằng cách ly tâm rồi hòa tan trong dung dịch SOL I, SOL II, SOL III, sau đó bổ sung isopropanol làm kết tủa DNA và protein. Làm sạch DNA bằng cồn 70%,
M 1 2
350bp 500bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 500bp M 1 2 2700bp 350bp
sau đó hoàn tan trong RNAase để loại hết RNA. Kết quả được điện di thể hiện trên hình 3.8 cho thấy, các mẫu DNA plasmid đều đảm bảo chất lượng để tiến hành các bước tiếp theo.
Hình 3.8. Kết quả điện di plasmid tinh sạch chứa đoạn gen LTP
(M. Marker 1kb;1. VC1973A-1; 2. VC1973A-2; 3. D15-1; 4. D15-2)
Để khẳng định các plasmid cần tìm có gắn đoạn gen mong muốn của sản phẩm PCR hay không, chúng tôi đã chọn mẫu plasmid đã tinh sạch để tiến hành thí nghiệm. Tiến hành cắt bằng enzyme giới hạn BamHI ở 370
C trong 2h, vị trí của BamHI ở vecto là nằm ở hai đầu đoạn gắn. Theo lý thuyết nếu phản ứng cắt plasmid bằng enzyme thành công thì sẽ thu được hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 2700bp của vecto pBT và đoạn DNA có kích thước khoảng 350bp của gen LTP. Kết quả phân tích cho thấy plasmid pBT tái tổ hợp mang đoạn gen đã được xen vào với kích thước phân tử tương đương với sản phẩm PCR và tương đương với kích thước theo lý thuyết.
Hình 3.9 . Kết quả điện di sản phẩm căt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme
BamHI (M. Marker 1kb; 1. VC1973A; 2. D15)
M 1 2 3 4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.9 cho thấy, sau khi tiến hành cắt sản phẩm plasmid bằng enzyme BamHI, được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel aragose 0,8% xuất hiện hai băng. Băng trên có kích thước khoảng 2700bp tương đương với kích thước của vector, băng dưới có kích thước khoảng 350bp tương ứng với đoạn gen LTP. Như vây, đoạn gen LTP đã được tách dòng thành công và đảm bảo chất lượng để xác định trình tự gen.
3.3.6. Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen LTP
Tiến hành xác định nucleotide của gen LTP ở hai mẫu nghiên cứu VC1973A và D15 trên máy xác định trình tự tự động, kết quả xác định trình tự được xử lý trên phần mềm DNAstar và BioEdit.
Kết quả phân tích trình tự gen của hai mẫu nghiên cứu (dòng D15 và VC1973A), đoạn gen tách dòng có kích thước đúng với dự tính, cho thấy chiều dài của gen LTP của hai mẫu nghiên cứu có kích thước 351 nucleotide. Như vậy, chúng tôi đã tách dòng và xác định được trình tự gen LTP của dòng D15 và VC1973A (Hình 3.10).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.10. Trình tự nucleoitde của gen LTP hai mẫu đậu xanh D15 và VC1973A
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.7. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen LTP ở các dòng đậu
xanh nghiên cứu
Dựa vào hình 3.10, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự gen của hai mẫu đậu xanh nghiên cứu. Kết quả cho thấy có 4 vị trí sai khác giữa giống gốc VC1973A và dòng D15 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước (Bảng 3.5).
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy sự sai khác về nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh VC1973A và dòng D15 thể hiện lần lượt ở các vị trí 1, 3 , 349, 350. Với các nucleotide sai khác ở VC1973A (T, G, A, G), dòng D15 (C, T, C, T). Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide của giống gốc VC1973A và D15 đạt 98,9%
Bảng 3.5. Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen LTP ở VC1973A và D15 STT Vị trí VC1973A D15
1 1 T C
2 3 G T
3 349 A C
4 350 G T
Từ kết quả xác định trình tự ở trên, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự gen của LTP của hai mẫu đậu xanh giống VC1973A và dòng D15 với các trình tự gen đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế (GenBank) với các mã số sau: AY300807, FM200034, HE589494, kết quả được thể hiện ở hình 3.11.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.11. Trình tự nucleotide của gen LTP hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15 với các trình tự đã công bố
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nucleotide Substitutions (x100) 0 1.0 D15.seq VC1973A.seq AY300807.seq HE589494.s eq FM200034.seq
Hình 3.11 cho thấy trình tự nucleotide của hai mẫu nghiên cứu VC1973A và D15 đều có hệ tương đồng với trình tự nucleotide của các gen đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế từ 97,4% đến 99,7%. Sự sai khác trong trình tự nucleotide bao gồm 10 vị trí được thể hiện ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Vị trí sai khác trình tự nuclotide của gen LTP hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15 với các trình tự đã công bố trên GenBank STT Vị trí AY300807 FM200034 HE589494 VC1973A D15
1 1 A A A T C 2 3 G G G G T 3 276 T A T T T 4 302 A T A A A 5 313 A T A A A 6 314 A G A A A 7 326 T T C T T 8 349 T T T A C 9 350 A A A G T 10 351 A A A T T
Trên cơ sở xác định trình tự nucleotide của hai mẫu đậu xanh nghiên cứu và so sánh với các trình tự nucleotide công bố trên Genbank xây dựng được cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm chuyên dụng (Hình 3.12)
Hình 3.12. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ giữa các trình tự gen LTP của các mẫu đậu xanh nghiên cứu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sơ đồ hình cây ở hình 3.12 cho thấy các trình tự gen so sánh được chia làm hai nhánh chính là: nhánh gen được công bố trên Genbank mã số FM200034 và nhánh còn lại gồm các gen công bố trên Genbank mã số AY300807, HE589494, D15, VC1973A. Hai mẫu trình tự VC1973A và D15 nằm trong nhánh nhỏ cùng với trình tự có mã số AY300807. Như vậy, hai trình tự mẫu đậu xanh nghiên cứu có quan hệ gần gũi với nhau và cũng có quan hệ gần gũi với các trình tự được công bố trên Genbank.
3.3.8. Kết quả so sánh trình tự amino acid của gen LTP ở các dòng đậu xanh nghiên cứu
Sử dụng phần mềm BioEdit dịch mã giả thuyết đoạn gen của hai mẫu đậu xanh nghiên cứu sang protein kết quả thu được 117 amino acid (Hình 3.13). Khi so sánh tổng hợp các vị trí tổng hợp amino acidcủa hai mẫu đậu xanh nghiên cứu nhận thấy rằng chỉ có duy nhất một vị trí amino acid thay đổi là vị trí 117. VC1973A vị trí 117 là S , dòng D15 vị trí 117 là L. Hai trình tự amino acid đạt mức độ tương đồng 99,1%.
Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid của gen LTP hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15
Chúng tôi tiếp tục tiến hành so sánh trình tự amino acid của hai mẫu đậu xanh nghiên cứu với các trình tự của các gen đã công bố trên Genbank (Hình 3.14)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.14. So sánh trình tự amino acid của gen LTP hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15 so với các mẫu trên Genbank
Kết quả phân tích hình 3.14 cho thấy trình tự amino acid của hai mẫu đậu xanh nghiên cứu có sự sai khác với 3 trình tự công bố trên Genbank lần lượt ở vị trí 1 và 117. Với trình tự amino acid mã số FM200034 sai khác ở vị trí 101, 105. Mã số HE589494 vị trí sai khác là 109.
Bảng 3.7. Vị trí sai khác amino acid của gen LTP hai mẫu đậu xanh VC1973A, D15 với các trình tự đã công bố trên Genbank
STT Vị trí AY300807 FM200034 HE589494 VC1973A D15
1 1 M M M L L
2 101 N I N N N
3 105 K W W W W
4 109 F F S F F
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN
1.1. Các tính trạng: chiều cao cây, số cành/ cây, chiều dài quả, số lượng quả, số hạt/quả, khối lượng 1000 hạt ở thế hệ R2 và R3 có xu hướng dần ổn định. Đã chọn được hai dòng có triển vọng là D15 và D40 dựa trên một số đặc điểm nông sinh học.
1.2. Hàm lượng protein của các dòng dao động từ 22,96%- 24,78%, hàm lượng lipit dao động từ 0,53 %- 0,74 %.
1.3. Đã nhân bản, tách dòng và xác định trình tự gen LTP của dòng đậu xanh D15 và giống gốc VC1973A. Kích thước của gen LTP của hai mẫu nghiên cứu là 351 nucleotide, mã hóa cho 117 amino acid.
1.4. Xác định được bốn vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen LTP và một vị trí sai khác trong trình tự amino acid do gen LTP mã hoá ở dòng đậu xanh D15 và giống gốc VC1973A.
1.5. So sánh với các trình tự gen LTP của dòng D15 và giống gốc VC1973A với các trình tự LTP đã công bố trên Genbank đã xác định được 10 vị trí sai khác về trình tự nucleotide và 5 vị trí sai khác trình tự amino acid.
2. ĐỀ NGHỊ
2.1. Cần tiếp tục trồng và theo dõi sự ổn định, đánh giá khả năng chịu hạn của dòng D15 và D40 để giới thiệu khảo nghiệm giống.
2.2. Tiếp tục nghiên cứu gen LTP của các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước để đánh giá khả năng chịu hạn của đậu xanh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Trần Bình và cs (1998), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến
giống cây trồng, NXB Nông nghiệp.
2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu
ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội.
3. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực
hành Hoá sinh học, NXB Giáo dục.
4. Nguyễn Mạnh Chính, Nguyễn Mạnh Cường (2008), Trồng đậu xanh, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội : 3-9.
5. Đường Hồng Dật (2006), Cây đậu xanh. Kỹ thuật thâm canh và biện pháp
tăng năng suất, chất lượng sản phẩm, NXB Lao Động - Xã Hội, tr: 5-3
6. Điêu Thị Mai Hoa, Lê Trần Bình (2005), „„ Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 57 giống đậu xanh (Vigna radiata L.) bằng kỹ thuật RAPD‟‟,
Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(1): 57-66.
7. Nguyễn Đăng Khôi (1997), “Các cây đậu ăn hạt ở Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, số 2, : 5-6.
8. Kết quả nghiên cứu khoa học đậu đỗ 1991- 1995 (1996), Viện Khoa học kỹ
thuật Nông nghiệp, Việt Nam : 4-188.
9.Kết quả nghiên cứu khoa học nông nghiệp 2000 (2001), NXB Nông Nghiệp.
10. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hoá sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở
Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
11. Trần Đình Long, Lê Khả Tường (1991), Những nghiên cứu mới về chọn
tạo giống đậu đỗ, NXB Nông nghiệp, Hà Nội : 2-20.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
13. Đỗ Tất Lợi (1997), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.