Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ lá đậu xanh
Phương pháp tách DNA tổng số theo Gawel và cs năm 1991 có cải tiến [30] như sau:
- Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.
- Bổ sung 0,8 ml đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8), Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nổi. Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ. Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
- Thêm 600 μl chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 5 phút. - Li tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút.
- Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.
- Thêm 500 μl isopropanol, để tủa DNA trong 30 phút ở -200C.
- Li tâm 13000 vòng /phút trong 15 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. - Bổ sung 500 μl cồn 70% búng nhẹ.
- Li tâm 7000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn, thu cặn. - Làm khô DNA bằng máy speed vac.
- Hoà tan DNA trong H2O khử ion.
Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số
Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng 2 phương pháp:
(1) Phương pháp quang phổ hấp thụ: Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bước sóng 260nm và 280nm. Nồng độ DNA trong dung dịch tách chiết được tính theo công thức:
Nồng độ DNA (ng/μl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng.
Độ sạch của DNA được xác định bằng tỷ lệ A260/A280. Dung dịch chứa DNA có tỷ lệ A260/A280 là 1,8- 2,0 được coi là đảm bảo chất lượng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(2) Phương pháp điện di: Điện di kiểm tra DNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8%. Sản phẩm điện di được nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
Kỹ thuật PCR
Sau khi tách chiết và kiểm tra được độ tinh sạch của DNA tiến hành nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR theo Mullis và cs (1985) với cặp mồi có trình tự nucleotide đặc hiệu.
DNA tổng số thu được được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR, với hàm lượng DNA sử dụng cho mỗi phản ứng PCR (dung tích 50 l) là khoảng 100-150 nanogam (ng). Bảng 2.2. Thành phần của PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước khử ion 38 2 NH4 + (Buffer) 5 3 dNTP (25mM) 2 4 Mồi xuôi (10 pM/µl) 1 5 Mồi ngược (10 pM/µl) 1
6 Taq-polymerase (5U/1µl) 1
7 DNA 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt độ trong phản ứng PCR
Nhiệt độ Thời gian (phút) Số chu kỳ
94oC 4 1 94oC 1 35 520C 1 72oC 3 72oC 10 1
4oC Nhiệt độ bảo quản tạm thời sản phẩm phản ứng
Sau chu kỳ cuối cùng, chuyển về nhiệt độ 4oC bảo quản trước khi tinh sạch, bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng.
Sản phẩm PCR nói chung được phát hiện khi điện di trên gel agarose 0,8-2%. Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu acid nucleic vào gel và đặt một điện áp vào đó. Các acid nucleic ở trên gel thường hiển thị ở dạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại khi nhuộm bằng Ethidium bromide và được quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại. Kích thước các băng DNA được so sánh với DNA marker được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt.
Tinh sạch sản phẩm PCR
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm có kích thước khoảng 350 bp cho vào ống eppendort 1,5 ml .
- Bổ sung 500 µl dung dịch Binding Buffer.
- Ủ ở 650C trong khoảng 5 phút, trộn nhẹ cho gel tan hoàn toàn thành dịch trong suốt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Cho lên cột li tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch nổi, thu cặn màu trắng.
- Bổ sung tiếp khoảng 500 µl Buffer wash, li tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để loại dịch nổi, thu tủa.
- Làm khô DNA trong box.
- Hoà tan DNA trong 20 µl H2O deion khử trùng.
- Li tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút để thu dịch nổi, bỏ tủa.
- Điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1%. Sản phẩm điện di được nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
Phƣơng pháp tạo dòng sản phẩm PCR
Tạo vectơ tái tổ hợp
Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch sẽ được gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT được thể hiện ở bảng 2.6.
Hỗn hợp được ủ ở 220C trong 1h, sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng
STT Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 1 T4 Ligase Buffer (10-20 ng/µl) 1 2 T4 DNA Ligase 1 3 pBT Vector 1 4 DNA 5 5 Nước 2 Tổng 10
Vectơ tái tổ hợp được đưa vào tế bào E. coli chủng DH 5α bằng một quá trình gọi là biến nạp (transformation). Đó là quá trình tạo cho plasmid đã được gắn nối, tiếp xúc với tế bào thích ứng nhằm tạo điều kiện cho chúng xuyên qua màng vào trong nguyên sinh chất. Khi đã được chuyển nạp, plasmid (có thể tái tổ hợp hoặc không) sẽ cùng nhân lên cùng với tế bào chủ khi nuôi trong môi trường dinh dưỡng thích hợp.
Quy trình biến nạp như sau:
Lấy tế bào khả biến bảo quản ở -800C, cho vào 2 ống để ngay trong đá. Lấy 5 µl sản phẩm ligase cho vào mỗi ống tế bào khả biến, để trong đá 20 phút. Ủ ở trong máy sốc nhiệt 420
C trong vòng 1 phút 30 giây, để trong đá 10 phút. Bổ sung 200 µl LB lỏng nuôi phục hồi ở 370C trong 1h bằng máy lắc. Sau đó tiến hành đổ đĩa, cho vào đĩa các thành phần: Carbe (20 µl), IPTG (20µl ), X- Gal (20 µl ). Cấy trải, dùng que cấy trải khử trùng trải đều đĩa nuôi cấy. Dán Parafil, bọc đĩa nuôi cấy bằng báo. Nuôi không lắc ở 370C qua đêm.
Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp
Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp thực hiện bằng hai phương pháp: chọn lọc theo phản ứng cơ chất (với X -gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp thành công vectơ tái tổ hợp, và chọn lọc theo phương pháp kháng sinh nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp được bất kỳ vectơ nào và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tách DNA plasmid tái tổ hợp
Các bước tiến hành tách DNA plasmid tái tổ hợp:
(1) Lấy 2ml dịch khuẩn cho vào ống eppendof ly tâm 8000 vòng trong 5 phút, bỏ dịch lỏng thu cặn.
(2) Hòa 150 µl Sol I (Glucose, Tris HCl pH=0.8, EDTA pH=0.8) lắc tan cặn. Hòa 200 µl Sol II (NaOH 0.2N, SDS 1%) lắc nhẹ. Thêm 150 µl Sol III (5M postasium acetate ,Glacial acetic acid, H20) . Ly tâm 13.000 vòng trong 15 phút, thu dịch lỏng sang ống eppendof 1.5ml. Cho 500 µl chloroform : isoamyl ly tâm 13.000 vòng trong 15 phút, hút dịch ở pha trên. Cho lượng tương đương Iso propanol vào lắc đều để trong đá 5 phút, sau đó ly tâm 13.000 vòng trong 10 phút đổ bỏ dịch. Cho 500 µl cồn 70% ly tâm 7000 vòng trong 5 phút bỏ dịch lỏng rồi dốc ngược ống để vào Box cho khô hết nước. Hòa tan cặn trong 20 µl nước khử ion.
Ký hiệu mẫu và bảo quản ở - 200
C.
Kiểm tra DNA tái tổ hợp
DNA ngoại lai là sản phẩm của PCR được tạo dòng vào plasmid pBTsẽ được plasmid nhân lên trong tế bào E. Coli. Kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng cắt plasmid tái tổ hợpbằng enzym
BamHI
Tên hóa chất Thể tích (µl)
Nước khử ion 3.5
DNA plasmid tái tổ hợp 5
Buffer BamHI 1
BamHI (10 unit/ µl) 0.5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Xử lý chuỗi gen và số liệu
Trình tự chuỗi nucleotide được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng trên máy tính. So sánh đối chiếu và xử lý số liệu của các chuỗi cuối cùng thu nhận được với các chuỗi có trong Ngân hàng gen quốc tế (Genbank) bằng chương trình Bioedit, DNAstar.