Các thí nghiệm được thực hiện và hoàn thành tại Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư Phạm ; Viện khoa học sự sống thuộc Đại học Thái Nguyên; Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC DÕNG ĐẬU XANH CHỌN LỌC VÀ GIỐNG GỐC
3.1.1. Đặc điểm nông sinh học của các dòng đậu xanh chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc ở thế hệ R2 từ mô sẹo chịu mất nƣớc ở thế hệ R2
Các dòng chọn lọc và giống gốc được gieo trồng ngoài đồng ruộng đều có khả năng sinh trưởng và phát triển bình thường (Hình 3.1).
Hình 3.1. Các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô seo chịu mất nƣớc thế hệ R2
Kết quả theo dõi, phân tích một số đặc điểm nông sinh học trong vụ đông xuân được trình bày ở bảng 3.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.1 Đặc điểm và mức độ biến dị của một số tính trạng nông sinh học và yếu tố cấu thành nên năng suất
STT
Chiều cao cây Số cành/cây Chiều dài quả
X CV % X CV % X CV % Giống gốc VC1973A 48,38± 1,69 22,41 6,00± 0,41 17,57 9,33± 0,32 12,27 D15 49,32±1,56 24,11 6,25± 0,39 27,20 9,22±0,36 14,77 D40 56,67±1,64 21,74 5,87± 0,57 24,11 8,69±0,45 17,62 D02 49,15±1,16 17,08 5,96±0 ,68 27,04 8,93±0,59 16,81 D20 47,83±1,18 16,61 5,58± 0,43 21,43 8,56±0,42 19,66
Yếu tố cấu thành năng suất
STT
Số lượng quả
(Quả) Tỉ lệ nhân (%) Số hạt/quả
(Hạt) Khối lượng 1000 hạt (g) X CV % X CV % X CV % X CV % VC1973 A 13,60±1,52 28,18 71,92±0,23 2,73 11,1±0,33 11,23 53,01±0,24 3,36 D15 13,53±1,12 19,62 72,70±0,28 3,24 11,2±0,39 14,63 52,56±0,18 2,53 D40 15,75±1,29 34,10 72,28±0,28 3,27 11,2±0,43 17,13 54,39±0,05 0,66 D02 14,22±1,42 36,51 71,06±0,19 2,16 10,1±0,61 17,4 53,23±0,08 1,16 D20 13,46±1,52 22,71 68,85±0,49 5,98 10,6±0,41 16,90 55,93±0,20 2,62
Chiều cao cây được tính từ mặt đất đến ngọn, chiều cao cây phụ thuộc vào giống và điều kiện canh tác. Mức độ biểu hiện của tính trạng chiều cao cây phản ánh sức sinh trưởng của cây đậu xanh. Kết quả phân tích ở bảng 3.1 cho thấy tính trạng chiều cao của các dòng chọn lọc và giống gốc được sắp xếp theo thứ tự từ cao đến thấp là: R2D40 >R2D15 > R2D02 >VC1973A > R2D20. Dòng D40 có chiều cao tăng cao nhất so với giống gốc 8.29 cm, các dòng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
D15, D02, D20 không có sự khác biệt rõ rệt so với giống gốc. Trong số 4 dòng theo dõi thì hai dòng D02 và D20 có hệ số biến động nhỏ hơn so với giống gốc từ 5,33% đến 5,80%.
Đậu xanh có 2 cấp cành và có số cành từ 5-12. Số cành thay đổi tùy thuộc vào mật độ trồng và điều kiện ngoại cảnh. Mật độ trồng càng dày thì khả năng phân cành ít, ngược lại mật độ trồng thích hợp khả năng phân cành cao hơn qua đó làm tăng số lượng quả. Kết quả theo dõi nhận thấy 3 dòng đậu xanh D40, D02, D20 có số cành trung bình giảm so với giống gốc và các dòng chọn lọc đều có hệ số biến động cao hơn giống gốc.
Quả đậu xanh khi chín có chiều dài trung bình từ 8 cm- 10 cm , quả dài nhất có thể đạt 15 cm. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy các dòng D40, D02, D20 có chiều dài quả trung bình ngắn hơn so với giống gốc và các dòng chọn lọc đều có hệ số biến động về tính trạng chiều dài quả cao hơn giống gốc.
Số lượng quả/cây là một trong những chỉ tiêu quan trọng và có mối tương quan chặt chẽ với năng suất đậu xanh. Số quả phụ thuộc vào từng giống đậu xanh, liên quan đến đặc điểm di truyền, ngoài ra còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố của ngoại cảnh. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy số quả trên cây của các dòng chọn lọc dao động từ 13- 15 quả /cây, dòng D40 và D02 có số lượng quả cao hơn giống gốc, nhưng hệ số biến động lại cao hơn (34,10%-36,51%). Hai dòng D15 và D20 lại có số quả trung bình thấp hơn giống gốc, nhưng có hệ số biến động lại thấp hơn (19,62% và 22,71%). Tất các dòng đều xuất hiện các biến dị về hình dạng quả như: quả nhỏ, quả ít hạt (1 hạt), eo thắt, quả không có hạt...
Tỉ lệ nhân là tỉ lệ giữa khối lượng hạt và khối lượng quả. Chỉ tiêu này phụ thuộc khá nhiều vào chiều dày vỏ, khả năng tích lũy vật chất khô trong hạt, tùy thuộc vào từng giống khác nhau. Giống có tỉ lệ nhân lớn sẽ có khả năng cho năng suất cao. Theo dõi các dòng đậu xanh ở thế hệ R2 thấy rằng tỉ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lệ nhân của các dòng dao động từ 68,85%- 72,70%, dòng cho tỉ lệ nhân lớn nhất là D15 (72,70%) với Cv%= 3,24%, dòng D20 có tỉ lệ nhân nhỏ nhất 68,85% với Cv%= 5,98%. Tỉ lệ nhân của các dòng chọn lọc so với giống gốc không có sự khác biệt quá lớn.
Số hạt /quả liên quan trực tiếp đến chiều dài của quả đậu xanh, qua đó cũng ảnh hưởng đến năng suất. Nhìn chung, số hạt/ quả của các dòng chọn lọc và giống gốc không có sự khác biệt lớn, nhưng các dòng chọn lọc lại có hệ số biến động Cv% cao hơn giống gốc.
Khối lượng 1000 hạt cùng là một trong những yếu tố cấu thành năng suất. Các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước và giống gốc có khối lượng 1000 hạt dao động từ 52,56g đến 55,93g và có hệ số biến động thấp. Các dòng chọn lọc đều có hệ số biến động thấp hơn giống gốc, dòng D40 có hệ số biến động Cv% = 0,66% thấp nhất trong các dòng. Khối lượng hạt cũng có thể thay đổi do chế độ chăm sóc, các mùa vụ khác nhau, điều kiện môi trường.
3.1.2. Đặc điểm nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất của các dòng đậu xanh ở thế hệ R3 đậu xanh ở thế hệ R3
Kết quả phân tích một số tính trạng nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất của các dòng đậu xanh ở thế hệ R3 được trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2 cho thấy ở thế hệ R3, các tính trạng chiều cao cây, số cành/cây, chiều dài quả của các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước phổ biến có hệ số biến động Cv% cao hơn giống gốc (trừ tính trạng chiều cao cây ở dòng D02- Cv%= 6,98%). Về tính trạng số quả/cây, hai dòng D15 và D40 có số quả /cây cao hơn giống gốc và hệ số biến động di truyền của tính trạng này ở tất cả các dòng đều thấp hơn giống gốc. Dòng D40 có số hạt/quả cao hơn giống gốc,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ba dòng D40, D02, D20 có khối lượng 1000 hạt cao hơn giống gốc và hệ số biến động của tính trạng này đều thấp hơn giống gốc ở tất cả các dòng.
Bảng 3.2. Đặc điểm, mức độ biến dị của một số tính trạng nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất của các dòng đậu xanh ở thế hệ R3
STT
Chiều cao cây (cm) Số cành/cây Chiều dài quả (cm)
X CV % X CV % X CV % VC1973A 55,00±0,69 9,27 6,53±0,40 15,68 9,55±0,37 8,67 D15 55,20±0,87 11,59 6,57±0,37 14,27 9,57±0,45 11,06 D40 55,13±0,91 12,22 5,93±0,50 20,35 9,67±0,52 11,30 D02 49,73±0,49 6,98 6,14±0,63 25,42 8,61±0,50 11,56 D20 50,33±0,67 9,49 5,26±0,40 17,30 9,07±0,57 14,36
Yếu tố cấu thành năng suất
STT
Số lượng quả/cây Tỉ lệ nhân (%) Số hạt/quả Khối lượng 1000 hạt (g)
X Cv% X Cv% X Cv X Cv % VC1973A 17,72±0,72 26,35 72,32±0,19 2,33 11,1±0,38 9,91 53,29±024 2,66 D15 18,54±0,44 19,26 73,35±0,26 2,99 11,1±0,48 11,59 53,65±0,18 2,36 D40 18,31±0,62 23,14 72,79±0,16 3,02 12,0±0,57 12,42 54,87±0,08 0,52 D02 14,63±0,38 14,21 71,26±0.21 1,92 10,7±0,55 18,71 54,02±0,13 0,66 D20 14,48±0,74 16,64 71,09±0,45 5,35 10,6±0,5 12,7 55,99±0,21 1,32
Kết quả theo dõi và đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học của các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước, nhận thấy hai dòng D15, D40 có nhiều đặc điểm nổi bật hơn so với giống gốc VC1973A.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.2. Các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc thế hệ R3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2. CHẤT LƢỢNG HẠT CỦA CÁC DÕNG ĐẬU XANH CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC
Để đánh giá chất lượng hạt của các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước ở thế hệ R2, chúng tôi tiến hành phân tích hàm lượng protein và lipid, kết quả được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hàm lƣợng protein, lipid của các dòng đậu xanh và giống gốc STT Tên dòng/ giống đậu xanh Hàm lƣợng protein (%) Hàm lƣợng lipid (%) 1 VC1973A 23,61 ± 0,16 0,62 ± 0,34 2 D15 23,84 ± 0,40 0,58 ± 0,37 3 D40 24,78 ± 0,42 0,53 ± 0,39 4 D02 23,74 ± 0,32 0,59 ± 0,30 5 D20 22,96 ± 0,18 0,74 ± 0,24
Qua bảng 3.3 cho thấy hàm lượng protein của các dòng đậu xanh dao động trong khoảng từ 22,96%- 24,78%, trong đó dòng D40 có hàm lượng protein cao nhất (24,78%), thấp nhất là dòng D20 (22,96%). Hàm lượng lipid của các dòng đậu xanh dao động từ 0,53%- 0,74 %, dòng D02 có hàm lượng cao nhất (0,74%), thấp nhất là D40 (0,53%), hàm lượng lipid của giống gốc là 0,62%. Theo Trần Đình Long (1991) hàm lượng protein trung bình trong hạt đậu xanh không tách vỏ từ 23%- 28%, hàm lượng lipid trung bình trong hạt đậu xanh không tách vỏ 1,3% [11], hàm lượng protein của các dòng chọn lọc và giống gốc phổ biến nằm trong khoảng này (trừ dòng D20). Hàm lượng lipid của tất cả các dòng đậu xanh nghiên cứu đều thấp hơn so với kết quả phân tích của Trần Đình Long và so với hàm lượng lipid của các dòng đậu xanh đột biến theo nghiên cứu của Chu Hoàng Mậu (2001) thấp hơn khá nhiều (4,15%- 6,53%).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ số liệu ở bảng 3.3, chúng tôi rút ra nhận xét: các giống có hàm lượng protein cao thì hàm lượng lipit lại thấp và ngược lại. Như vậy hàm lượng protein và lipit có mối tương quan nghịch. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Chu Hoàng Mậu (1991) [15] và Trần Thị Phương Liên (1999) [10].
3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN LTP 3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA tổng số là bước khởi đầu cho mọi nghiên cứu sinh học phân tử. Tiến hành tách chiết DNA tổng số từ hệ gen của giống gốc VC1973A và dòng D15 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước theo phương pháp của Gawel và Jarret (1991). DNA tổng số được kiểm tra chất lượng bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X, nhuộm bản gel bằng ethydium bromide, soi dưới ánh đèn cực tím và chụp ảnh (Hình 3.4). Tiếp theo chúng tôi tiến hành kiểm tra hàm lượng và chất lượng DNA tổng số đã tách chiết được bằng phương pháp quang phổ hấp thụ, kết quả thu được hàm lượng DNA tổng số của dòng đậu xanh D15 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước và giống gốc dao động từ 245,6- 935 (mg/ml), tỷ lệ OD260/OD280 dao động từ 1,80 – 1,94. Như vậy, DNA tổng số thu được đảm bảo chất lượng cho các thao tác và phân tích DNA của đối tượng nghiên cứu.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di DNA tổng số tách chiết từ mô lá của giống đậu xanh VC1973A và dòng D15 (M. Maker; 1. VC1973A; 2. D15)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.2. Kết quả nhân gen LTP từ hệ gen của dòng D15 và giống gốc
Chúng tôi tiến hành nhân bản gen LTP có kích thước của gen ước tính khoảng 350bp bằng kỹ thuật PCR từ DNA hệ gen với cặp mồi có trình tự thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Trình tự mồi nhân gen LTP
Tên mồi Trình tự nucleotide Nhiệt độ gắn mồi
LTPF 5‟ GATTGTTAGCGCAGTTGGTGAAG 3‟ 520C
LTPR 5‟ GGCTAGCCTGAAGGTTGCATG 3‟ 520C
Kết quả nhân gen được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím (Hình 3.5).
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kết quả nhân gen LTP
(M. Marker 1kb; 1. VC1973A; 2. D15)
Hình 3.5 cho thấy đoạn gen LTP nhân được có kích thước 350bp và có hàm lượng đủ lớn để thực hiện tách dòng. Độ dài đoạn DNA thu được có kích thước phù hợp với kết quả tính toán lý thuyết.
350bp 500bp
250bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tiến hành tinh sạch (thôi gel) sản phẩm đoạn gen LTP bằng bộ kit của Hãng Bioneer (AccuPrep PCR Purification Kit). Kết quả điện di cho thấy sản phẩm sau khi được tinh sạch đảm bảo yêu cầu về hàm lượng và chất lượng.
3.3.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Sản phẩm thôi gel của 2 mẫu D15 và VC1973A đạt yêu cầu sẽ được gắn vào vector tách dòng pBT nhờ enzyme nối T4 ligase. Phản ứng ghép nối dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa hai đầu nucleotide A thò ra ở sản phẩm PCR với Taq - polymerase và hai đầu nucleotide T trên vector tách dòng pBT. Hỗn hợp được ủ ở 220
C trong 1 giờ cho phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α và được cấy trải trên môi trường LB đặc (cao nấm men, Bacto Tryptime, NaCl, bacto Aga technical) có bổ sung kháng sinh Carbe (20mg/l), X-gal (20mg/l) và IPTG (20µM). Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ. Kết quả thu được có cả khuẩn lạc màu xanh và màu trắng được thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. Hình ảnh khuẩn lạc
Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vecto pBT hoạt động bình thường, không có đoạn gen lạ nào chèn vào, khi có chất cảm ứng IPTG bổ sung vào sẽ tổng hợp enzyme chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Những khuẩn lạc màu trắng có thể đã nhận được đoạn gen lạ chèn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
vào, nên không hoạt động, khi bổ sung chất cảm ứng IPTG thì gen không tổng hợp enzyme chuyển hóa cơ chất X-gal. Các khuẩn lạc màu trắng mang plasmid tái tổ hợp sẽ được chọn lọc bằng phương pháp colony- PCR
3.3.4. Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang vecto tái tổ hợp
Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng PCR với cặp mồi LTPF/LTPR để xác định khuẩn lạc có mang gen mong muốn. Sản phẩm colony -PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím (Hình 3.7).
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR
(M. Marker 1kb; 1. VC1973A; 2. D15)
Từ kết quả điện di ở hình 3.7 cho thấy sản phẩm colony-PCR từ những khuẩn lạc màu trắng đều cho kết quả một băng duy nhất đúng kích thước 350bp của gen LTP. Điều này đã khẳng định kết quả biến nạp và chọn dòng đã được thực hiện thành công.
3.3.5. Kết quả tách và kiểm tra plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu
Nuôi khuẩn lạc trắng mang gen LTP đã được chọn bằng colony- PCR. Lấy 2 µl môi trường LB lỏng, tế bào được thu bằng cách ly tâm rồi hòa tan trong dung dịch SOL I, SOL II, SOL III, sau đó bổ sung isopropanol làm kết tủa DNA và protein. Làm sạch DNA bằng cồn 70%,
M 1 2
350bp 500bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 500bp M 1 2 2700bp 350bp
sau đó hoàn tan trong RNAase để loại hết RNA. Kết quả được điện di thể hiện trên hình 3.8 cho thấy, các mẫu DNA plasmid đều đảm bảo chất lượng để tiến hành các bước tiếp theo.
Hình 3.8. Kết quả điện di plasmid tinh sạch chứa đoạn gen LTP
(M. Marker 1kb;1. VC1973A-1; 2. VC1973A-2; 3. D15-1; 4. D15-2)
Để khẳng định các plasmid cần tìm có gắn đoạn gen mong muốn của sản phẩm PCR hay không, chúng tôi đã chọn mẫu plasmid đã tinh sạch để tiến