Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng PCR với cặp mồi LTPF/LTPR để xác định khuẩn lạc có mang gen mong muốn. Sản phẩm colony -PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím (Hình 3.7).
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR
(M. Marker 1kb; 1. VC1973A; 2. D15)
Từ kết quả điện di ở hình 3.7 cho thấy sản phẩm colony-PCR từ những khuẩn lạc màu trắng đều cho kết quả một băng duy nhất đúng kích thước 350bp của gen LTP. Điều này đã khẳng định kết quả biến nạp và chọn dòng đã được thực hiện thành công.
3.3.5. Kết quả tách và kiểm tra plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu
Nuôi khuẩn lạc trắng mang gen LTP đã được chọn bằng colony- PCR. Lấy 2 µl môi trường LB lỏng, tế bào được thu bằng cách ly tâm rồi hòa tan trong dung dịch SOL I, SOL II, SOL III, sau đó bổ sung isopropanol làm kết tủa DNA và protein. Làm sạch DNA bằng cồn 70%,
M 1 2
350bp 500bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 500bp M 1 2 2700bp 350bp
sau đó hoàn tan trong RNAase để loại hết RNA. Kết quả được điện di thể hiện trên hình 3.8 cho thấy, các mẫu DNA plasmid đều đảm bảo chất lượng để tiến hành các bước tiếp theo.
Hình 3.8. Kết quả điện di plasmid tinh sạch chứa đoạn gen LTP
(M. Marker 1kb;1. VC1973A-1; 2. VC1973A-2; 3. D15-1; 4. D15-2)
Để khẳng định các plasmid cần tìm có gắn đoạn gen mong muốn của sản phẩm PCR hay không, chúng tôi đã chọn mẫu plasmid đã tinh sạch để tiến hành thí nghiệm. Tiến hành cắt bằng enzyme giới hạn BamHI ở 370
C trong 2h, vị trí của BamHI ở vecto là nằm ở hai đầu đoạn gắn. Theo lý thuyết nếu phản ứng cắt plasmid bằng enzyme thành công thì sẽ thu được hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 2700bp của vecto pBT và đoạn DNA có kích thước khoảng 350bp của gen LTP. Kết quả phân tích cho thấy plasmid pBT tái tổ hợp mang đoạn gen đã được xen vào với kích thước phân tử tương đương với sản phẩm PCR và tương đương với kích thước theo lý thuyết.
Hình 3.9 . Kết quả điện di sản phẩm căt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme
BamHI (M. Marker 1kb; 1. VC1973A; 2. D15)
M 1 2 3 4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.9 cho thấy, sau khi tiến hành cắt sản phẩm plasmid bằng enzyme BamHI, được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel aragose 0,8% xuất hiện hai băng. Băng trên có kích thước khoảng 2700bp tương đương với kích thước của vector, băng dưới có kích thước khoảng 350bp tương ứng với đoạn gen LTP. Như vây, đoạn gen LTP đã được tách dòng thành công và đảm bảo chất lượng để xác định trình tự gen.