bào soma
Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đang được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chọn giống cây trồng, đặc biệt là chọn giống chống chịu được các stress môi trường: chịu lạnh, chịu muối, chịu nhôm.. [2].
Chu Hoàng Mậu và đồng tác giả (2006) tiến hành xử lý bằng thổi khô mô sẹo các giống lạc MĐ7, L17, L14, L18, ĐBG đã nhận thấy mô sẹo của 5 giống lạc đều bị mất nước nhanh, khả năng chịu mất nước của các giống có sự khác nhau rõ rệt, cao nhất là ĐBG và thấp nhất là L18 [16].
Nguyễn Thị Tâm (2004), đã tạo được 197 dòng mô có khả năng chịu nóng ở 400C, 420C và 520 dòng cây lúa. Từ 33 dòng qua 5 thế hệ đã chọn được 2 dòng nổi bật là HR128 với đặc điểm là cây thấp, số hạt chắc/bông cao, hàm lượng protein, đường tan, amino acid liên kết trong hạt cao, có khả năng chịu nóng, cứng cây và dòng HR499 với khả năng đẻ nhánh hữu hiệu, số hạt chắc/bông, năng suất khóm, có khả năng chịu nóng cao hơn so với giống gốc [21].
Lê Trần Bình và cs (1998) đã chọn được hai dòng có khả năng chịu muối là C0 và C8. Bằng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù từ mô sẹo lúa trong môi trường có bổ sung AlCl3 ở nồng độ từ 0 – 600ppm có pH tương ứng từ 5,8 – 2,71.
Bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro, Nguyễn Thị Vinh, Lê Duy Thành và cộng sự (1995) nghiên cứu khả năng chịu nhôm và axit của các giống lúa : ĐC3, CM10, Pokaly, Cườm, Chiêm bầu, CR203, NN8, OM 861-20, OM296 và Tép lai, đã thu được các dòng mô sẹo của giống Pokaly và Cườm có khả năng chịu được AlCl3 ở 600ppm và pH là 2,71. Mô sẹo của giống Tép lai, CR203 chịu được AlCl3 ở 400ppm và pH là 2,98 [22].
Ngoài ra, nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả về việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong cải tiến giống cây trồng trên các đối tượng khác nhau cũng đã được nghiên cứu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Vật liệu
Giống đậu xanh VC1973A do bộ môn hệ thống canh tác của Viện nghiên cứu ngô cung cấp, nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế, có hạt tròn, màu xanh nâu –bóng, chịu hạn kém. Các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của giống VC1973A bao gồm: D15, D40, D02, D20 do Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, .khoa Sinh- KTNN, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên cung cấp.
2.1.2. Các hóa chất chuyên dụng
Hóa chất dùng trong các phân tích hóa sinh và phân tích sinh học phân tử gồm các loại hóa chất mua của các hãng của Anh, Đức, Mỹ, Trung Quốc, như: EDTA, CTAB, TAE, aragose…và các hóa chất thông dụng khác. Bộ kit của hãng BIONEER, cặp mồi dùng cho phản ứng PCR đặt của hãng BIONEER, enzyme giới hạn: BamHI.
2.1.3. Thiết bị
Bảng 2.1. Danh mục các thiết bị sƣ̉ dụng
STT Tên thiết bị Nguồn gốc xuất sứ
1 Máy PCR Amplied Biosystems USA/Singapore
2 Bộ điện di Scie – plas Ltd – UK
3 Máy chụp ảnh gel Gel Logic 1500 – Kodak –USA
4 Máy lắc SK3000 – Jeotech – Korea
5 Máy Vortex Vortex Genius 3 – IKA Genmany/China
6 Máy DNA sequencing ABI Prism 3130 – USA/Japan
7 Cân điện tử TE 214S – Startorius Germany
8 Bể ổn nhiệt Techne – OSI
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Qui trình tiến hành thí nghiệm thực hiện theo sơ đồ sau:
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.2.1. Nghiên cứu ngoài đồng ruộng
Thí nghiệm trên đồng ruộng được tiến hành tại xã Phấn Mễ- Huyện Phú Lương. Các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo mất nước và giống đối chứng được trồng trong cùng điều kiện và theo dõi sự phát triển của các dòng qua các giai đoạn phát triển trong vụ đông xuân. Đánh giá đặc điểm nông học thông qua các chỉ tiêu: chiều cao cây, số nhánh/cây, số quả chắc/cây, chiều dài quả, khối lượng quả, số hạt/ cây, khối lượng 1000 hạt, tỉ lệ nhân.
2.2.2. Thống kê sinh học
Sử dụng toán thống kê để xác định trị số thống kê như trung bình mẫu (X ), phương sai (2
), độ lệch chuẩn (), và sai số trung bình mẫu ( SX ), hệ Hạt của các dòng chọn
lọc thế hệ R2
Trồng ngoài đồng ruộng
Đánh giá đặc điểm nông học Phân tích chỉ tiêu hóa sinh
Hạt của các dòng chọn lọc ở thế hệ R3
Dòng triển vọng Trồng ngoài đồng ruộng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
số biến động ( Cv). Các số liệu được xử lý trên máy tính theo chương trình Excel theo tài liệu của Chu Văn Mẫn (2003) [14].
2.2.3. Phân tích hóa sinh
Định lượng lipid tổng số
Xác định hàm lượng lipid dựa trên nguyên tắc hòa tan của lipid trong dung môi hữu cơ là ete dầu hỏa (petroleum ether). Hạt đậu xanh được sấy khô ở 700C đến khối lượng không đổi, nghiền mịn, cân 0,05 g bột mẫu cho vào ống eppendorf 2 ml, thêm 1,5 ml petroleum ether, lắc đều trong 10 phút, bảo quản mẫu ở 40C trong 24 giờ. Sau đó mang đi li tâm 12000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, loại bỏ dịch. Lặp lại quy trình như trên 3 lần.
Hàm lượng lipid tính bằng hiệu số khối lượng mẫu trước và sau khi chiết phần trăm khối lượng khô.
Công thức tính: % L = 100%
a b a
Trong đó: a: Khối lượng mẫu trước khi chiết b: Khối lượng mẫu sau khi chiết L: Hàm lượng lipid
Định lượng protein
Định lượng protein trong đậu xanh theo phương pháp của Lowry được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu, 1998 [3]. Sử dụng đệm chiết protein là phosphat citrat pH = 10, NaCl 1M và nước cất. Protein được chiết ở 4oC trong 24 giờ. Dịch chiết chứa protein hòa tan đem xác định hàm lượng cùng protein chuẩn là albumin huyết thanh bò theo phương pháp quang phổ hấp thụ bước sóng 750 nm với thuốc thử Foling. Đơn vị tính hàm lượng protein là phần trăm khối lượng khô.
Hàm lượng protein được tính theo công thức X% 100
g H a
%
Trong đó: X: Hàm lượng protein khô a: Số đo trên máy quang phổ ( mg/ml )
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.4. Phân tích sinh học phân tử
Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ lá đậu xanh
Phương pháp tách DNA tổng số theo Gawel và cs năm 1991 có cải tiến [30] như sau:
- Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.
- Bổ sung 0,8 ml đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8), Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nổi. Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ. Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
- Thêm 600 μl chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 5 phút. - Li tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút.
- Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.
- Thêm 500 μl isopropanol, để tủa DNA trong 30 phút ở -200C.
- Li tâm 13000 vòng /phút trong 15 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. - Bổ sung 500 μl cồn 70% búng nhẹ.
- Li tâm 7000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn, thu cặn. - Làm khô DNA bằng máy speed vac.
- Hoà tan DNA trong H2O khử ion.
Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số
Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng 2 phương pháp:
(1) Phương pháp quang phổ hấp thụ: Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bước sóng 260nm và 280nm. Nồng độ DNA trong dung dịch tách chiết được tính theo công thức:
Nồng độ DNA (ng/μl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng.
Độ sạch của DNA được xác định bằng tỷ lệ A260/A280. Dung dịch chứa DNA có tỷ lệ A260/A280 là 1,8- 2,0 được coi là đảm bảo chất lượng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(2) Phương pháp điện di: Điện di kiểm tra DNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8%. Sản phẩm điện di được nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
Kỹ thuật PCR
Sau khi tách chiết và kiểm tra được độ tinh sạch của DNA tiến hành nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR theo Mullis và cs (1985) với cặp mồi có trình tự nucleotide đặc hiệu.
DNA tổng số thu được được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR, với hàm lượng DNA sử dụng cho mỗi phản ứng PCR (dung tích 50 l) là khoảng 100-150 nanogam (ng). Bảng 2.2. Thành phần của PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước khử ion 38 2 NH4 + (Buffer) 5 3 dNTP (25mM) 2 4 Mồi xuôi (10 pM/µl) 1 5 Mồi ngược (10 pM/µl) 1
6 Taq-polymerase (5U/1µl) 1
7 DNA 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt độ trong phản ứng PCR
Nhiệt độ Thời gian (phút) Số chu kỳ
94oC 4 1 94oC 1 35 520C 1 72oC 3 72oC 10 1
4oC Nhiệt độ bảo quản tạm thời sản phẩm phản ứng
Sau chu kỳ cuối cùng, chuyển về nhiệt độ 4oC bảo quản trước khi tinh sạch, bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng.
Sản phẩm PCR nói chung được phát hiện khi điện di trên gel agarose 0,8-2%. Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu acid nucleic vào gel và đặt một điện áp vào đó. Các acid nucleic ở trên gel thường hiển thị ở dạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại khi nhuộm bằng Ethidium bromide và được quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại. Kích thước các băng DNA được so sánh với DNA marker được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt.
Tinh sạch sản phẩm PCR
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm có kích thước khoảng 350 bp cho vào ống eppendort 1,5 ml .
- Bổ sung 500 µl dung dịch Binding Buffer.
- Ủ ở 650C trong khoảng 5 phút, trộn nhẹ cho gel tan hoàn toàn thành dịch trong suốt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Cho lên cột li tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch nổi, thu cặn màu trắng.
- Bổ sung tiếp khoảng 500 µl Buffer wash, li tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để loại dịch nổi, thu tủa.
- Làm khô DNA trong box.
- Hoà tan DNA trong 20 µl H2O deion khử trùng.
- Li tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút để thu dịch nổi, bỏ tủa.
- Điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1%. Sản phẩm điện di được nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
Phƣơng pháp tạo dòng sản phẩm PCR
Tạo vectơ tái tổ hợp
Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch sẽ được gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT được thể hiện ở bảng 2.6.
Hỗn hợp được ủ ở 220C trong 1h, sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng
STT Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 1 T4 Ligase Buffer (10-20 ng/µl) 1 2 T4 DNA Ligase 1 3 pBT Vector 1 4 DNA 5 5 Nước 2 Tổng 10
Vectơ tái tổ hợp được đưa vào tế bào E. coli chủng DH 5α bằng một quá trình gọi là biến nạp (transformation). Đó là quá trình tạo cho plasmid đã được gắn nối, tiếp xúc với tế bào thích ứng nhằm tạo điều kiện cho chúng xuyên qua màng vào trong nguyên sinh chất. Khi đã được chuyển nạp, plasmid (có thể tái tổ hợp hoặc không) sẽ cùng nhân lên cùng với tế bào chủ khi nuôi trong môi trường dinh dưỡng thích hợp.
Quy trình biến nạp như sau:
Lấy tế bào khả biến bảo quản ở -800C, cho vào 2 ống để ngay trong đá. Lấy 5 µl sản phẩm ligase cho vào mỗi ống tế bào khả biến, để trong đá 20 phút. Ủ ở trong máy sốc nhiệt 420
C trong vòng 1 phút 30 giây, để trong đá 10 phút. Bổ sung 200 µl LB lỏng nuôi phục hồi ở 370C trong 1h bằng máy lắc. Sau đó tiến hành đổ đĩa, cho vào đĩa các thành phần: Carbe (20 µl), IPTG (20µl ), X- Gal (20 µl ). Cấy trải, dùng que cấy trải khử trùng trải đều đĩa nuôi cấy. Dán Parafil, bọc đĩa nuôi cấy bằng báo. Nuôi không lắc ở 370C qua đêm.
Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp
Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp thực hiện bằng hai phương pháp: chọn lọc theo phản ứng cơ chất (với X -gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp thành công vectơ tái tổ hợp, và chọn lọc theo phương pháp kháng sinh nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp được bất kỳ vectơ nào và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tách DNA plasmid tái tổ hợp
Các bước tiến hành tách DNA plasmid tái tổ hợp:
(1) Lấy 2ml dịch khuẩn cho vào ống eppendof ly tâm 8000 vòng trong 5 phút, bỏ dịch lỏng thu cặn.
(2) Hòa 150 µl Sol I (Glucose, Tris HCl pH=0.8, EDTA pH=0.8) lắc tan cặn. Hòa 200 µl Sol II (NaOH 0.2N, SDS 1%) lắc nhẹ. Thêm 150 µl Sol III (5M postasium acetate ,Glacial acetic acid, H20) . Ly tâm 13.000 vòng trong 15 phút, thu dịch lỏng sang ống eppendof 1.5ml. Cho 500 µl chloroform : isoamyl ly tâm 13.000 vòng trong 15 phút, hút dịch ở pha trên. Cho lượng tương đương Iso propanol vào lắc đều để trong đá 5 phút, sau đó ly tâm 13.000 vòng trong 10 phút đổ bỏ dịch. Cho 500 µl cồn 70% ly tâm 7000 vòng trong 5 phút bỏ dịch lỏng rồi dốc ngược ống để vào Box cho khô hết nước. Hòa tan cặn trong 20 µl nước khử ion.
Ký hiệu mẫu và bảo quản ở - 200
C.
Kiểm tra DNA tái tổ hợp
DNA ngoại lai là sản phẩm của PCR được tạo dòng vào plasmid pBTsẽ được plasmid nhân lên trong tế bào E. Coli. Kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng cắt plasmid tái tổ hợpbằng enzym
BamHI
Tên hóa chất Thể tích (µl)
Nước khử ion 3.5
DNA plasmid tái tổ hợp 5
Buffer BamHI 1
BamHI (10 unit/ µl) 0.5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Xử lý chuỗi gen và số liệu
Trình tự chuỗi nucleotide được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng trên máy tính. So sánh đối chiếu và xử lý số liệu của các chuỗi cuối cùng thu nhận được với các chuỗi có trong Ngân hàng gen quốc tế (Genbank) bằng chương trình Bioedit, DNAstar.
2.2.5. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm được thực hiện và hoàn thành tại Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư Phạm ; Viện khoa học sự sống thuộc Đại học Thái Nguyên; Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC DÕNG ĐẬU XANH CHỌN LỌC VÀ GIỐNG GỐC
3.1.1. Đặc điểm nông sinh học của các dòng đậu xanh chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc ở thế hệ R2 từ mô sẹo chịu mất nƣớc ở thế hệ R2