- Chén sứ nhỏ. - Kim mũi giác - Dao lam. - Lame, lamelle. - Bán cầu lỗ. - Kính hiển vi vật kính có độ phóng đại X 100 - Nước Javel. - Nước cất. 3.2.2. Thao tác
Cắt mẫu nguyên liệu (lá, cành), thành những lát mỏng, cho vào chén sứ chứa Javel để loại nội dung tế bào trong 3 phút.
80
Đặt mẫu vừa cắt vào một giọt nước trên lame, đậy lamelle lại sao cho không có bọt khí rồi quan sát dưới kính hiển vi.
3.3 Khảo sát sự ly trích tinh dầu
Việc ly trích tinh dầu thông ba lá được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Hoá học Hữu cơ, khoa Hoá học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. HCM.
3.3.1 Thiết bị và hoá chất Hoá chất Hoá chất
Dietil eter khan (Trung Quốc). Na2SO4 khan (Trung Quốc). Aceton
Thiết bị, dụng cụ:
- Cân phân tích 4 số lẻ SARTORIUS CP 342S.
- Lò vi sóng gia dụng cải tiến SANYO EM – D95535 (Nhật) - Bộ chưng cất Clevenger nhẹ
- Máy cô quay HEIDOIPH VV 2000.
3.3.2 Phương pháp chưng cất hơi nước đun nóng truyền thống Nguyên liệu: Nguyên liệu:
• 20 g nhựa thông nghiền nhỏ,
• 100 g lá thông cắt nhỏ
• 100 g cành thông non cắt nhỏ
Cho nguyên liệu vào bình cầu 2000 ml, thêm vào một lượng nước xác định. Lắp hệ thống chưng cất hơi nước, tiến hành chưng cất trong các khoảng thời gian xác định (tính từ giọt ngưng tụ đầu tiên) để xác định thời gian ly trích tối ưu.
81
Để nguội, trích lấy phần tinh dầu trong ống gạn bằng dietil eter. Làm khan nước bằng Na2SO4 khan.
Lọc dưới áp suất kém. Cô quay thu hồi dung môi. Cân chính xác lượng tinh dầu ly trích được.
Xác định hàm lượng tinh dầu trên khối lượng nguyên liệu tương ứng.
3.3.3 Phương pháp chưng cất hơi nước chiếu xạ vi sóng
• 20 g nhựa thông nghiền nhỏ
• 100 g lá thông cắt nhỏ
• 100 g cành thông non cắt nhỏ
Cho nguyên liệu vào bình cầu 2000 ml, thêm vào một lượng nước xác định. Lắp hệ thống chưng cất hơi nước, chiếu xạ vi sóng trong các khoảng thời gian (tính từ giọt ngưng tụ đầu tiên) để xác định thời gian ly trích tối ưu.
Để nguội, trích lấy phần tinh dầu trong ống gạn bằng dietil eter. Làm khan nước bằng Na2SO4 khan.
Lọc dưới áp suất kém. Cô quay thu hồi dung môi. Cân chính xác lượng tinh dầu ly trích được.
Xác định hàm lượng tinh dầu trên khối lượng nguyên liệu tương ứng.
3.4. Xác định chỉ số vật lý
3.4.1 Tỷ trọng
3.4.1.1 Lý thuyết
Tỷ trọng của tinh dầu được xác định bằng tỷ số giữa khối lượng tinh dầu và khối lượng nước ở cùng một thể tích.
82
Công thức tính: 29 29
d =
Với m0: Khối lượng trung bình của bình đo tỷ trọng
m1: Khối lượng trung bình của nước cất và bình đo tỷ trọng m2: Khối lượng trung bình của tinh dầu và bình đo tỷ trọng
Tỷ trọng của tinh dầu dao động từ 0.7 – 1.2. Hầu hết các tinh dầu đều có tỷ trọng nhỏ hơn 1 (nhẹ hơn nước) trừ một vài tinh dầu như tinh dầu hương nhu, long não, quế, …
Tỷ trọng tinh dầu thường phụ thuộc vào thành phần hoá học của tinh dầu. Những tinh dầu có chứa nhiều hợp chất hidrocarbon thường có tỷ trọng nhỏ hơn 0.9. Những tinh dầu có chứa nhiều hợp chất oxigen, hợp chất hương phương thường có tỷ trọng lớn hơn 1.
Tỷ trọng tương đối của tinh dầu tại 20 °C, 20 20
d , là tỷ số khối lượng tinh dầu ở 20 °C trên khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở 20 °C.
Ở 20 °C, nước có tỷ trọng 0.99823 g/ml.
3.4.1.2 Thực hành
Thiết bị, dụng cụ:
Tỷ trọng kế
Cân phân tích có độ chính xác tới 0.0001 g. Nhiệt kế chia vạch tới 0.2 oC.
Thao tác:
Rửa sạch tỷ trọng kế bằng aceton, để khô tự nhiên. Cân tỷ trọng kế, ghi nhận giá trị mo.
83
Cho nước cất vào tỷ trọng kế, đậy nắp, gắn nhiệt kế và lau khô phân nước trào ra. Cân và ghi nhận giá trị m1.
Đổ nước cất ra, rửa sạch tỷ trọng kế lại bằng aceton, để khô tự nhiên.
Cho tinh dầu vào tỷ trọng kế theo cách thức trên. Cân khối lượng tỷ trọng kế và tinh dầu, ghi nhận giá trị m2.
Sai lệch giữa hai lần cân xác định liên tiếp không quá 0.001 g. Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 3 lần xác định liên tiếp.
Từ công thức tính tỷ trọng, suy ra tỷ trọng của tinh dầu (có hiệu chỉnh nhiệt độ). Bảng 3.1. Tỷ trọng ở 20 oC của tinh dầu thông ba lá
Bộ phận Phương pháp ly trích Lần cân m0 m1 m2 20 20 d Nhựa CHHD 1 25.5340 29.8936 29.2658 0.8560 2 25.5339 29.8945 29.2679 3 25.5340 29.8913 29.2625 MIHD 1 25.5339 29.8916 29.3055 0.8586 2 25.5339 29.8955 29.3097 3 25.5340 29.8976 29.2801 Lá CHHD 1 25.5339 29.8990 29.1967 0.8391 2 25.5340 29.8943 29.1942 3 25.5340 29.8929 29.1940 MIHD 1 25.5340 29.8958 29.0867 0.8145 2 25.5339 29.8921 29.0862 3 25.5339 29.8910 29.0860 Cành CHHD 1 25.5339 29.8968 29.1944 0.8390 2 25.5339 29.8958 29.1944 3 25.5339 29.8964 29.4945 MIHD 1 25.5339 29.8941 29.1389 0.8268 2 25.5340 29.8941 29.1388 3 25.5340 29.8962 29.1390
84
3.4.2. Chỉ số khúc xạ
3.4.2.1 Lý thuyết
Chỉ số khúc xạ (hay còn gọi là chiết suất) là tỷ số giữa sin góc tới và sin góc khúc xạ của một tia sáng có độ dài sóng xác định đi từ không khí qua tinh dầu ở một nhiệt độ xác định.
Người ta thường dùng ánh sáng của đèn natrium (D) có độ dài sóng 589.3 ± 0.3 nm. Nhiệt độ tham chiếu là 20 oC (trừ trường hợp tinh dầu không ở thể lỏng ở nhiệt độ này thì phải chọn 25 hoặc 30 oC).
Chỉ số khúc xạ được tính bằng công thức = + 0.0004 (t’ – t) Với:: Chỉ số khúc xạ ở nhiệt độ quy định (20 oC)
: Chỉ số khúc xạ đo ở nhiệt độ t’
3.4.2.2. Thực hành
Thiết bị:
Máy khúc xạ kế
Thao tác:
Rửa sạch nơi chứa mẫu bằng aceton. Cho vài giọt tinh dầu lên nơi chứa mẫu.
Bật đèn và kéo ngọn đèn đến gần phía nơi chứa mẫu.
Chỉnh nút để thấy rõ được vùng sáng tối trong mẫu. Ranh giới giữa hai vùng là đường cắt ngang của đường chéo.
Bấm nút READ để đọc kết quả, ghi nhận lại. Bấm nút TEMP để đọc nhiệt độ, ghi nhận lại.
85
Thực hiện 3 lần để lấy kết quả trung bình.
Bảng 3.2. Chỉ số khúc xạ ở 20 oC của tinh dầu thông ba lá
Bộ phận Phương pháp ly trích Lần đo nD29 t’ nD20 Nhựa CHHD 1 1.4669 29.0 1.4630 2 1.4665 28.9 3 1.4665 29.1 MIHD 1 1.4458 29.0 1.4426 2 1.4463 29.1 3 1.4464 29.1 Lá CHHD 1 1.4757 29.0 1.4721 2 1.4757 29.0 3 1.4757 29.0 MIHD 1 1.4825 29.2 1.4790 2 1.4728 29.2 3 1.4825 29.3 Cành CHHD 1 1.4839 29.0 1.4802 2 1.4837 29.2 3 1.4838 29.2 MIHD 1 1.4730 28.9 1.4695 2 1.4734 29.0 3 1.4729 29.1
86
3.4.3 Góc quay cực
3.4.3.1 Lý thuyết.
Góc quay cực của tinh dầu (ký hiệu ) được tính bằng độ, là góc quay của mặt phẳng ánh sáng phân cực của ánh sáng có độ dài sóng 589.3 ± 0.3 nm, khi ánh sáng này được truyền ngang qua một ống chứa tinh dầu dài 1 dm trong những điều kiện nhất định.
Những tinh dầu làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực theo chiều kim đồng hồ được gọi là tinh dầu hữu triền (+, d), ngược lại gọi là tinh dầu tả triền (-, l).
3.4.3.2 Thực hành
Dụng cụ:
Triền quang kế A. Krüss Optronic GmbH P8000 Ống chứa tinh dầu dài 5 cm.
Thao tác:
Chuẩn bị mẫu tinh dầu cần đo.
Bật nguồn sáng triền quang kế cho đến khi đạt được cường độ sáng. Rửa sạch ống chứa mẫu bằng aceton, để khô tự nhiên.
Cho tinh dầu vào đầy ống chứa mẫu. Khi đậy nắp phải chú ý không được để lẫn bọt khí vào ống.
Đặt ống chứa mẫu vào máy, đậy nắp lại. Đọc và ghi nhận kết quả giá trị góc quay và chiều quay.
87
Bảng 3.3. Góc quay cực của tinh dầu thông ba lá
Bộ phận Phương pháp ly trích Lần đo Kết quả 20
D α Nhựa CHHD 1 +12.273 +24.576 2 +12.300 3 +12.288 MIHD 1 +12.301 +24.374 2 +12.175 3 +12.187 Lá CHHD 1 -23.502 -47.376 2 -23.757 3 -23.805 MIHD 1 -23.389 -46.992 2 -23.500 3 -23.599 Cành CHHD 1 +2.481 +4.964 2 +2.470 3 +2.495 MIHD 1 +2.266 +4.346 2 +2.100 3 +2.153
88
3.5 Xác định chỉ số hoá học
3.5.1 Chỉ số acid (IA)
3.5.1.1 Lý thuyết
Chỉ số acid (IA) là số mg KOH cần thiết để trung hoà các acid tự do có trong 1 g tinh dầu.
Cùng một loại tinh dầu, chỉ số acid có thể thay đổi tuỳ theo phương pháp khai thác và thời gian tồn trữ. Trong các tinh dầu tồn trữ lâu, các hợp chất ester có thể bị thuỷ giải hoặc các hợp chất aldehid bị oxi hoá nên chỉ số acid thường cao hơn so với tinh dầu mới sản xuất.
Phản ứng trung hoà acid tự do có trong tinh dầu RCOOH + KOH → RCOOK + H2O Chỉ số acid được tính bằng công thức:
IA = .
x KOH x CKOH
Với mtd: Khối lượng tinh dầu (g).
VKOH: Thể tích dung dịch KOH (ml). CKOH: Nồng độ dung dịch KOH
3.5.1.2 Thực hành
Dụng cụ và hoá chất:
Erlen 100 ml. Ống đong 5 ml.
Microburette 5 ml, độ chia 0.01 ml. Phenolptalein trong EtOH (0.2 g/l).
89
KOH 0.1 N (pha trong EtOH 95 %). Etanol 95 %.
Thao tác:
Cân 0.200 ± 0.005 g tinh dầu cho vào erlen 100 ml. Thêm 5 ml etanol, 1-2 giọt phenolptalein, lắc đều. Chuẩn độ bằng KOH 0.1 N, ghi nhận KOH sử dụng Thực hiện 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Bảng 3.4. Chỉ số acid của tinh dầu thông ba lá
Bộ phận Phương pháp ly trích Lần Khối lượng tinh dầu (g) Thể tích KOH (ml) IA Nhựa CHHD 1 0.2001 0.015 0.38 2 0.2005 0.015 3 0.2007 0.015 MIHD 1 0.2024 0.010 0.35 2 0.2012 0.010 3 0.2018 0.015 Lá CHHD 1 0.2038 0.075 2.10 2 0.2009 0.070 3 0.2017 0.075 MIHD 1 0.2004 0.070 1.90 2 0.2045 0.075 3 0.2047 0.075 Cành CHHD 1 0.2039 0.186 5.12 2 0.2024 0.185 3 0.2020 0.184 MIHD 1 0.2067 0.183 4.97 2 0.2043 0.182 3 0.2914 0/180
90
3.5.2 Chỉ số savon hoá
3.5.2.1 Lý thuyết
Chỉ số savon hoá (IS) là số mg KOH cần thiết để tác dụng với tất cả acid tự do và acid kết hợp dưới dạng ester có trong 1 g tinh dầu.
Chỉ số savon hoá được tính bằng công thức IS = .
x (Vo-HCl) x CHCl
Với Vo: Thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu trắng (ml) VHCl: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu tinh dầu (ml) mtd: Khối lượng tinh dầu (g).
CHCl: Nồng độ dung dịch HCl.
3.5.2.2 Thực hành
Dụng cụ, hoá chất:
Bình cầu cổ nhám 100 ml chịu được kiềm. Ống hoàn lưu nước.
Burette 20 ml, có vạch chia 0.1 ml. HCl 0.1 N
KOH 0.1 N (pha trong etanol 95 %). Phenolptalein trong etanol (2 g/l).
Thao tác:
Cân khoảng 0.200 ± 0.005 cho vào bình phản ứng. Thêm 20 ml dung dịch KOH 0.1 N và vài viên đá bọt. Lắp ống hoàn lưu, đun cách thuỷ trong 1 giờ 30 phút.
Để nguội, tháo ống hoàn lưu, cho thêm vào 20 ml nước cất và vài giọt phenolptalein.
91
Chuẩn độ bằng HCl 0.1 N.
Thực hiện tương tự với mẫu trắng (nước cất). Bảng 3.5 Chỉ số savon hoá của tinh dầu thông ba lá
Bộ phận Phương pháp ly trích Lần Khối lượng tinh
dầu (g) Vo VHCl IS Nhựa CHHD 1 0.2005 20 19.91 2.53 2 0.2013 20 19.91 3 0.2034 20 19.92 MIHD 1 0.2015 20 19.94 1.61 2 0.2065 20 19.95 3 0.2043 20 19.94 Lá CHHD 1 0.2019 20 19.66 9.42 2 0.2039 20 19.67 3 0.2037 20 19.67 MIHD 1 0.2019 20 19.67 8.64 2 0.2011 20 19.70 3 0.2064 20 19.71 Cành CHHD 1 0.2053 20 19.35 17.68 2 0.2073 20 19.36 3 0.2039 20 19.34 MIHD 1 0.2016 20 19.37 17.07 2 0.2022 20 19.37 3 0.2067 20 19.35
3.5.3 Chỉ số ester hoá (IE)
Chỉ số ester hoá (IE) là số mg KOH cần thiết để trung hoà lượng acid phóng thích ra khi thuỷ giải các ester có trong 1 g tinh dầu.
Dựa vào định nghĩa này, chỉ số ester hoá được tính bằng công thức IE = IS - IA
92
3.6 Xác định thành phần hoá học
Mẫu tinh dầu được phân tích bằng thiết bị sắc ký khí đầu dò ion hoá ngọn lửa (GC/FID) và sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MSD).
3.6.1 Phân tích GC/FID
Máy Agilent GC 7890A-FID.
Cột HP-5 (30 m, 0.32 mm, 0.25 µm film) Sử dụng nitrogen làm khí mang ở 8.7 psi. Nhiệt độ đầu nạp: 250 oC.
Nhiệt độ đầu dò: 300 oC.
Tỷ lệ chia dòng 1/20, thể tích tiêm 1 µl.
Chương trình nhiệt: Nhiệt độ đầu 60 oC, tăng 3 oC/phút đến 240 oC
Sắc ký đồ dùng để xác định hàm lượng % các cấu tử có trong mẫu tinh dầu.
3.6.2 Phân tích GC/MSD
Máy Agilent GC 7890A-MS 5975C.
Cột TR-5MS (30 m, 0.32 mm, 0.25 µm film) Sử dụng helium làm khí mang ở áp suất 19.248 psi. Nhiệt độ đầu nạp 250 oC.
Tỷ lệ chia dòng 1/20, thể tích tiêm 1 µl.
Chương trình nhiệt: Nhiệt độ đầu 60 oC, tăng 3 oC/phút đến 240 oC. Ghi nhận khối phổ m/z trong khoảng 30-500, năng lượng ion hoá 70 eV.
93
Sử dụng sắc ký đồ của dãy đồng đẳng n-alkan để tính toán chỉ số số học AI (Arithmetic index) theo Adams, kết hợp với thư viện phổ NIST 2008 của máy để nhận danh các cấu tử trong mẫu tinh dầu.
Công thức tính AI
AI= ∗[ ]
!
3.7 Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật
Mẫu tinh dầu thông ba lá được thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật tại phòng thí nghiệm Vi khuẩn- khoa Vi sinh miễn dịch- Viện Pasteur TP. HCM trên 8 chủng vi khuẩn và 1 chủng vi nấm.
Nguyên tắc:
Hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán kiểm soát trên thạch
Trải vi khuẩn với một số lượng nhất định trên mặt thạch, sao cho tiếp xúc đều. Đặt đĩa giấy đã tẩm tinh dầu sẵn lên bề mặt thạch. Tinh dầu sẽ khuếch tán vào trong thạch và ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật, tạo thành vòng kháng vi sinh vật xung quanh đĩa giấy.
3.7.1 Thiết bị và hoá chất.
Hộp petri Que gòn
Kẹp được hấp khử trùng.
Giấy lọc Whatman dày, đường kính 6 mm, được hấp khử trùng. Đèn cồn
94
Đầu típ vàng, đầu típ xanh Eppendof
Nồi hấp khử trùng. Tủ sấy
Tủ ấm 37 oC. Dietil eter
Môi trường nuôi cấy MHA (Mueller Hinton Agar), Sabouraud Agar Độ đục chuẩn Mc Farland 0.5
3.7.2 Phương pháp tiến hành
Hấp khử trùng đĩa petri trong 50 phút, để trong tủ sấy 3 giờ cho đĩa khô hoàn toàn.
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nấu sôi và khuấy đều. Cho môi trường vào bình thuỷ tinh hấp khử trùng trong 50 phút.
Cho khoảng 20 ml môi trường nuôi cấy vào mỗi đĩa petri, ủ ở 37 oC trong 24 giờ để kiểm tra sự vô trùng.
Cấy các chủng vi khuẩn cần kiểm định vào mỗi đĩa petri (nồng độ vi sinh vật khoảng 108 tế bào).
Dùng kẹp đã được hấp khử trùng đặt các đĩa giấy lọc Whatman vào các lọ tinh dầu (loại nguyên chất và đã được pha loãng), đặt lên mặt thạch đã được cấy sẵn vi khuẩn cần kiểm định. Mỗi đĩa petri đặt 4 đĩa giấy cách đều nhau, ủ ở 37 oC.
Sau 24 giờ, lấy ra quan sát và đo đường kính vòng vô trùng
3.8 Cô lập α-pinen từ tinh dầu
3.8.1 Dụng cụ, hoá chất
95
Cân phân tích có độ chính xác tới 0.0001 g. Cột sắc ký Erlen 250 ml Becher 250 ml Ống đong 5 ml Ống đong 100 ml Vial 1.5 ml Tủ sấy
Tinh dầu nhựa thông ly trích bằng phương pháp CHHD Nitrat bạc AgNO3
Nước cất
Cloroform (Trung Quốc) Hexan (Trung Quốc) Acetat etil (Trung Quốc) Vanilin
Acid sulfuric Silica gel
Bản mỏng sắc ký
3.8.2 Thực hành
Pha dung dịch AgNO3 trong nước cất với các nồng độ 6-25%. Ngâm bản sắc ký trong các dung dịch vừa pha trong 2 giờ
96
Giải ly tinh dầu nhựa thông bằng bản sắc ký vừa thu được với các dung môi thích hợp để tim hệ dung môi sắc ký cột thích hợp
Sau khi xác định được nồng độ AgNO3 và hệ dung môi giải ly, tiến hành tẩm AgNO3 lên silica gel dùng để sắc ký cột.
Phương pháp chế hoá silica gel
Hoà tan 12.5 g AgNO3 trong 10 ml nước cất. Trộn đều 10 g silica gel với dung