Theo Ernest J. Parry (1921), tinh dầu nhựa thông ba lá chứa cấu phần chính là
d-α-pinen, góc quay cực từ +18o - +36o, chỉ số khúc xạ 1.4700. [8]
Theo E. Gildemeister, nhựa thông ba lá trồng tại Burma có hàm lượng tinh dầu khoảng 13 %, tỷ trọng 0.8627, góc quay cực +36.28o, thành phần chính là d-α-pinen. Bên cạnh đó, thông ba lá trồng tại Philippines cho hàm lượng nhựa cao hơn (23.4 %), tỷ trọng tinh dầu 0.8593, góc quay cực +13 - +27o, chỉ số khúc xạ ( 30 oC) là 1.4656. Thành phần chính của tinh dầu là d-α-pinen và β-pinen. [46,47,48]
Năm 1966, nhóm tác giả E. Zavarin, N. T. Mirov, E. N. Cooling, K. Snaberk và K. Costello thực hiện việc khảo sát tinh dầu thông tại Malaysia, trong đó có thông ba lá và thông hai lá (Pinus merkusii), kết quả cho thấy thông ba lá có hàm lượng α-pinen trong tinh dầu là 82.6%, thấp hơn hàm lượng hợp chất này trong tinh dầu thông hai lá (92.2%). [9]
Cũng trong năm 1966, nhóm tác giả E. Zavarin, N. T. Mirov và K. Snajberk công bố kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học tinh dầu của các loại thông trồng tại Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam [10]. Các loại thông được khảo sát trong đề tài này bao gồm P. khasya Royle, P. yunnanenis Franchet và P. insularis Endlicher. Các
14
loại thông này thường được xếp vào cùng một loài, gọi chung là P. kesiya Royle nhưng cũng có một số tác giả phân biệt chúng thành ba loài riêng biệt.
Bảng 1.1: Thành phần hoá học của tinh dầu nhựa thông
Loại thông Nguồn gốc
Cấu phần chính (%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
P. yunnanenis Vân Nam 90.1 1.0 4.5 2.0 - 0.5 0.5 0.5 - 0.1
P. khasya Assam 70.0 0.5 10.0 - - 0.5 1.0 2.5 - 10.0 Burma 75.3 0.6 20.0 - - 0.4 0.4 2.4 - - Việt Nam 78.5 - 1.5 - 0.5 1.2 0.5 17.0 0.5 0.1 P. insularis Philippines 82.0 0.5 1.0 - - 1.5 1.0 11.5 0.5 1.0 1. α-Pinen 6. Mircen 2. Camphen 7. Limonen 3. β-Pinen 8. β-Phelandren 4. 3-Caren 9. Terpinolen 5. Sabinen 10. Longifolen
Tinh dầu nhựa thông ba lá P. khasya ở Việt Nam chứa nhiều α-pinen và được đặc trưng bởi hàm lượng β-phelandren cao, nhưng chứa rất ít β-pinen so với các loại thông khác.
Giữa các loại thông có sự khác nhau đáng kể về các cấu phần cũng như thành phần của các hợp chất trong tinh dầu. Tinh dầu thông P. yunnanensis có hàm lượng α- pinen cao nhất, tinh dầu P. khasya trồng tại Burma được đặc trưng bởi hàm lượng β- pinen cao nhất trong các loại thông được khảo sát.
15
Sự khác nhau về thành phần hoá học trong tinh dầu là do nguồn gốc, thổ nhưỡng, khí hậu ở nơi trồng ảnh hưởng.
Năm 1968, nhóm tác giả E. Zavarin, N. T. Mirov, E. N. Cooling, K. Snaberk và K. Costello thực hiện việc khảo sát tinh dầu thông ba lá trồng tại Zambia [49]. Thông ba lá ở Zambia (châu Phi) được trồng từ hạt giống có nguồn gốc tại các nước châu Á. Từ Ấn Độ (vùng Assam), Myanmar (Burma), vùng Đông Dương (Đà Lạt, Việt Nam), Philippines (phía bắc Luzon), và Madagascar, hạt thông giống được du nhập về trồng tại Zambia.
Tinh dầu nhựa thông thu được được phân tích thành phần các terpen và sesquiterpen bằng phương pháp sắc ký khí-lỏng, sử dụng máy sắc ký Aerograph Hy-Fi Model 600 C kết nối với bộ thu tín hiệu Brown-Honeywell.
Bảng 1.2: Thành phần hoá học của tinh dầu thông ba lá trồng tại Zambia
Cấu phần Assam Burma Đà Lạt Madagascar Luzon
α-Pinen 64.0 96.5 94.0 92.0 87.0 Camphen 1.0 0.5 0.5 1.0 0.5 β-Pinen 32.0 1.0 0.5 1.5 1.0 Mircen 0.5 0.5 0.5 0.5 1.0 Limonen 1.5 0.5 1.0 2.5 1.0 β-Phelandren 1.5 1.0 3.5 2.5 9.5 α-Longipinen 0.5 3.5 - vết vết Longiciclen Tr 0.5 - vết vết Longifolen 6.5 vết vết 0.5 1.0
16
Thông ba lá có nguồn gốc từ Assam có hàm lượng longifolen và β-pinen cao nhất. Trong khi đó, những cây thông có nguồn gốc từ Việt Nam và Philippines được đặc trưng bởi hàm lượng hai hợp chất này thấp nhưng lại có β-phelandren chiếm tỉ lệ khá cao.
Bảng số liệu cũng cho thấy những cây thông có nguồn gốc từ Burma có nồng độ β-phelandren và β-pinen đều thấp nhưng hàm lượng longifolen lại chiếm tỷ lệ cao.
Các loài thông đến từ Việt Nam, Myanmar và Madagascar tinh dầu giàu α- pinen, rất thích hợp cho việc ly trích pinen để làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp dược và mỹ phẩm.
Năm 1983, Din Jingkai, Ding Lisheng, Yi Yuanfen, Wu Yu và Sun Handong (Trung Quốc) xác định thành phần hoá học của tinh dầu nhựa thông ba lá (P. kesiya var. lanbianensis (A. Chev.) Gaussen trồng tại Vân Nam [11]. Kết quả thành phần hoá học của tinh dầu gồm α-pinen (49.20%), β-pinen (25.9%), camphen (2.96 %), mircen (2.82%), ∆-3-caren (2.98 %), β-phelandren (9.49%), terpinolen (1.40 %) và longifolen (2.76 %).
Năm 1998, Nguyễn Trường Sơn thực hiện khảo sát tinh dầu thông ba lá trồng tại Đà Lạt, Lâm Đồng [5]. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng tinh dầu từ 13.5 – 14 %, lượng α-pinen trong tinh dầu chiếm từ 65 – 68%, ngoài ra còn có lượng β-pinen khá cao (khoảng 14 %), β-phelandren chiếm từ 6 – 7%.
Năm 2008, nhóm tác giả Li Si-guang, Fu Yu-pin đã thực hiện việc khảo sát các mẫu tinh dầu từ thông ba lá (P. kesiya var. langbianensis) tại Trung Quốc [50] , xác định tinh dầu của loài thông này chứa nhiều α-pinen, β-pinen (chiếm hơn 50%) và ∆- caren. Cùng với sự ly trích tinh dầu, sản phẩm phụ của quá trình ly trích là tùng hương được xác định chứa nhiều acid isopimaric.
Năm 1972, Mehra và Dwivedi (Ấn Độ) thực hiện các nghiên cứu trên các loài thông trồng phổ biến tại Ấn Độ, trong đó có thông ba lá [13]. Khảo sát này được thực
17
hiện trên diện rộng nhằm so sánh tính chất tinh dầu của chúng dựa trên các thông số như: màu sắc, thành phần hoá học, tỷ trọng, góc quay cực…
Các loại thông được khảo sát bao gồm:
Pinus roxburghii (Chir pine).
Pinus wallichiana (Blue pine).
Pinus kesiya (Khasi pine).
Pinus gerardiana (Chilgoza pine).
Bảng 1.3a: Hàm lượng, tính chất tinh dầu các loài thông
Loài Hàm lượng (%) Màu sắc Góc quay cực Tỷ trọng P. roxburghii 20-24 Trắng -7.80 0.87 P. wallichiana 21-26 Trắng vàng +8.60 0.89 P. kesiya 17-22 Trắng -12.70 0.86 P. gerardiana 27.5-27.9 Trắng đục +32.35 0.87
Bảng 1.3b: Cấu phần chính trong tinh dầu các loại thông
Loại thông Cấu phần chính
α-Pinen Camphen β-Pinen 3-Caren Limonen Longifolen
P. roxburghii 20.00 0.17 1.98 54.15 1.27 15.85
P. wallichiana 91.70 3.04 3.64 - 0.58 0.65
P. kesiya 25.16 0.35 68.92 - 1.69 0.95
18
Hàm lượng trung bình tinh dầu nhựa thông ba lá thấp hơn rất nhiều so với các loài thông khác.
Tinh dầu thông ba lá ở Ấn Độ chứa chủ yếu là β-pinen, lượng α-pinen chiếm hàm lượng thấp (từ 25-30 %).
Góc quay cực của tinh dầu thông ba lá được xác định là -12.70o, thuộc loại tả triền.
1.4.1.3 Hoạt tính kháng khuẩn
Theo nghiên cứu trước đây của Nguyễn Trường Sơn (1998), tinh dầu nhựa thông ba lá có hoạt tính kháng khuẩn yếu. Tác giả sử dụng tinh dầu nhựa thông hai lá và ba lá để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn bằng hai phương pháp là phương pháp đục lỗ và phương pháp đĩa giấy. Kết quả thu được được trình bày trong bảng 1.4.
Bảng 1.4: Đường kính vòng vô khuẩn của tinh dầu nhựa thông (mm)
Vi khuẩn
Thông ba lá Thông hai lá
Đục lỗ Đĩa giấy Đục lỗ Đĩa giấy
S. aureus 16 8 18 18
E. coli 13 10 15 13
S. faecalis 9 0 9 0
Tinh dầu nhựa thông có tính kháng khuẩn yếu.
Tinh dầu nhựa thông hai lá có hoạt tính cao hơn so với tinh dầu thông ba lá.
1.4.2 Lá thông
19
Lá thông ba lá là một đối tượng ít được nghiên cứu và kháo sát về mặt tinh dầu. Chỉ có một số ít các nghiên cứu của Philippines và Trung Quốc được công bố trên thế giới.
Năm 1984, Manas và Exconde (Philippines) sử dụng bộ ly trích tinh dầu Clevenger để ly trích tinh dầu hai loại thông là thông hai lá và thông ba lá [51]. Hiệu suất tinh dầu thông ba lá thu được từ 0.33 – 1.81% tuỳ thuộc vào độ tươi của lá. Tác giả cũng sử dụng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ để xác định thành phần hoá học của tinh dầu. Các cấu phần chính trong tinh dầu thông ba lá bao gồm α-pinen (58.31%), d-limonen (22.40%), acetat bornil (6.73%), ngoài ra còn có các hợp chất khác như camphen, β-pinen, mircen, 1,8-cineol, α-phelandren, linalol, cariophilen, borneol, terpineol, acetat geranil và γ-octalacton.
Năm 2008, Ma Hui-fen và cộng sự sử dụng GC-MS để xác định thành phần hoá học của tinh dầu lá thông ba lá [13]. Kết quả cho thấy các cấu phần chính trong tinh dầu lá thông bao gồm α-pinen, β-pinen, mircen và limonen.
Trên thị trường có bán tinh dầu lá thông được ly trích từ thông Scotch (P. sylvestris) và thông lùn P. nigra với các cấu phần chính tương tự như tinh dầu lá thông ba lá.
Bảng 1.5 : Thành phần hoá học tinh dầu lá một số loại thông thường gặp [14]
Hợp chất P. halepensis P. brutia P. nirga P. pinea P. canariensis P. caribaea P. pinaster Tujen 0.16 0.02 0.40 0.08 0.01 - - α-Pinen 13.40 16.03 52.19 5.13 14.01 - 40.50 Camphen 0.44 0.81 2.17 0.34 0.30 - 0.75 Sabinen 1.27 0.88 0.08 0.35 0.02 - - β-Pinen 1.13 45.66 2.03 2.65 1.86 - 25.42 Mircen 6.62 2.35 1.33 2.31 8.84 3.78 3.61
20 p-Cimen - - - - - - 4.02 α-Phelandren 0.05 0.04 0.11 0.62 - - - 3-Caren 6.87 0.50 0.40 - 0.01 - - α-Terpinen 0.30 0.10 0.35 0.15 0.03 - - Limonen 5.03 1.63 2.24 39.05 1.44 48.84 3.52 β-Phelandren 1.27 1.11 0.31 13.80 0.09 - - Ocimen 1.77 1.85 1.20 1.59 0.91 - - γ-Terpinen 0.42 0.26 0.23 0.22 0.11 - 0.08 Terpinolen 3.07 1.32 1.06 0.47 0.18 - 0.74 Linalol 0.78 0.66 0.14 0.12 0.05 - - Fenchol 0.11 0.11 0.04 - 0.02 - - Borneol 0.02 0.11 0.03 - 0.03 - - 4-Terpineol 0.70 0.46 0.22 0.16 0.02 - 0.21 Terpineol 0.54 1.20 1.00 0.91 0.75 - 1.05 α-Copaen - - - - - - 0.40 Longifolen - - - - - - 1.92 Acetat linalil - 0.24 0.02 - - - -
Metil timil eter 0.10 - - 0.66 - - -
Acetat fenchil 0.28 0.38 0.78 0.19 0.21 - - Acetat terpenil 0.01 0.81 0.37 - 0.27 - - Acetat citronelil - - 0.03 0.14 - - - Acetat neril 0.36 0.06 0.12 0.09 0.22 - - Acetat geranil 0.19 0.33 0.07 0.08 0.44 - - δ-Elemen 0.03 - 0.13 0.27 - - - Cariophilen 19.05 4.85 5.67 2.21 0.05 - -
21 α-Humulen 3.36 0.92 0.97 0.41 1.47 23.82 1.08 Calaren 0.39 0.06 0.09 0.15 0.26 - - Germacren D 0.50 7.63 14.27 4.23 50.55 8.40 3.21 Oxid cariophilen - - - - - 3.66 0.29 Aristolen 1.09 0.12 0.38 1.24 0.50 - - 3-metil-2- Pheniletil butanoat 6.57 0.83 2.10 1.00 1.00 - - α-Gurjunen 1.18 0.30 0.25 0.14 0.76 - - α-Murolen 0.53 0.12 0.45 0.28 0.91 - - δ-Cadinen 0.55 0.35 1.09 0.35 3.26 - - γ-Cadinen - - - - - - 1.09 Elemol 0.36 0.31 0.06 0.08 0.29 - - Guiaol 1.05 - 0.26 2.79 0.14 - - Globulol 0.01 - 0.05 0.82 0.18 - - Eudesmol 0.41 0.32 0.38 0.77 0.63 - - Cembren 7.62 0.88 0.57 - 0.01 - -
Các loại thông khác nhau có thành phần hoá học trong tinh dầu lá cũng khác nhau.
Các cấu phần chính thường xuất hiện trong tinh dầu là α-và β-pinen, mircen, cariophilen, α-và β-phelandren và germacren D.
Tinh dầu lá thông P. pinaster và P. nigra có hàm lượng α-pinen cao nhất. Tinh dầu lá thông P. densiflora S. and Z. có thành phần hoá học tương đối khác biệt so với các loài thông trên. Các cấu phần chính trong tinh dầu là trans-α-ocimen
22
(29.3 %), β-mircen (9.6 %), sabinen (10.9 %), β-cadinen (10.2 %), đặc biệt có sự hiện diện của các aldehid chi phương như n-hexanal (0.7 %) và 2-hexanal (4.5 %).
Mặt khác, tinh dầu lá thông trên thị trường thường được ly trích từ lá và cành non, hai nguyên liệu này thường không được tách riêng mà thường sử dụng chung trong ly trích, được gọi chung là tinh dầu lá thông để phân biệt với tinh dầu thông ly trích từ nhựa thông.
Một số nghiên cứu khác còn thực hiện việc ly trích tinh dầu từ trái (nón) thông. Theo kết quả khảo sát trên nón thông P. sylvestris tại Thổ Nhĩ Kỳ, thành phần hoá học của tinh dầu nón thông như sau.
Bảng 1.6: Một số cấu phần chính trong tinh dầu nón thông Thổ Nhĩ Kỳ [15]
Stt AI Cấu phần % GC 1 936 α-Pinen 14.76 2 978 β-Pinen 1.78 3 1194 Mirtenal + Mirtenol 1.22 4 1403 Longifolen 1.16 5 1420 β-Cariophilen 2.87 6 1578 Oxid cariphilen 12.58 7 1607 Epoxid humulen 1.48 8 1960 19-Norabieta-8.11.12-trien 4.75 9 1987 Norabieta-4(18),8,11,13-tetraen 4.59 10 2007 18-Norabieta-8.11.12-trien 15.78 11 2055 Abieta-8,11,13-trien 5.20 12 2247 Palustral 1.54 13 2278 Dehidroabietal 7.12
23
Tinh dầu nón thông chứa các cấu phần tương tự như tinh dầu lá thông. Bên cạnh đó, trong tinh dầu nón thông còn có các acid thương hiện diện trong nhựa thông với hàm lượng khá cao.
1.4.2.2 Hoạt tính sinh học
Hoạt tính kháng vi sinh vật của lá thông ba lá hầu như chưa được nghiên cứu trên thế giới. Tuy nhiên, cũng như về thành phần hoá học, hoạt tính kháng vi sinh vật của lá thông của các loài thông khác đã được nghiên cứu rất chi tiết. Hoạt tính kháng vi sinh vật có thể được phân loại thành hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính kháng nấm. 1.4.2.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn
Tinh dầu lá thông nói chung kháng được nhiều loại vi khuẩn, cả vi khuẩn gram âm và gram dương. Tuỳ theo thành phần hoá học của mỗi loại tinh dầu mà hoạt tính kháng khuẩn biểu hiện cường độ mạnh yếu hoặc có tác dụng trên các chủng vi khuẩn khác nhau.
Theo nghiên cứu của Oluwadayo-Sonibare và Olakunle (Nigeria) [16], tinh dầu lá thông Pinus caribaea có thành phần chính là β-phelandren (67.9%), β-cariophilen (10.2%) và α-pinen (5.4%). Các chủng vi khuẩn được sử dụng để thử nghiệm trong nghiên cứu này là các vi khuẩn đường ruột. Kết quả cho thấy tinh dầu lá thông P.
caribaea chỉ có tác dụng ức chế sự phát triển trên chủng Pseudomonas aeruginosa, nồng độ tinh dầu thử nghiệm tối thiểu là 10000 ppm, đường kính vòng vô khuẩn đo được là 25 mm.
Theo Letizia và cộng sự, tinh dầu lá thông P. nigra có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn B.subtilis[17]
. Tác giả Opdyke cũng xác định lá thông P.sylvestris có khả năng ức chế mạnh các loại vi khuẩn đường ruột được thử nghiệm trong khi lá thông P.pumilio có khả năng kháng khuẩn mạnh trên chủng Staphylococus aureus và một số loại vi khuẩn khác [18].
24
Về tinh dầu lá thông ba lá, chưa có tác giả nào trên thế giới công bố nghiên cứu về hoạt tính kháng nấm của loại tinh dầu này. Tuy nhiên, thông qua các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của tinh dầu lá của các loại thông khác, cũng giúp ta có nhận định bước đầu về hoạt tính sinh học của tinh dầu lá thông ba lá.
Năm 2002, các tác giả M. Krauze-Baranowska, M. Mardarowicz, M. Wiwart thực hiện khảo sát hoạt tính kháng nấm giống Fusarium trên tinh dầu lá các loại thông
P. ponderosa, P. resinosa và P. strobes [19]. Tinh dầu lá các loại thông này được khảo sát tại nồng độ 2 % và đo khả năng ức chế sự phát triển của nấm. Kết quả được trình bày trong bảng 1.7.
Bảng 1.7. Hoạt tính kháng nấm của tinh dầu lá một số loại thông
Loại thông F. culmorum F. poae F. solani
P. ponderosa 100 78 ± 5 100
P. resinosa 32 ±7 92 ± 4 84 ±8
P. strobus 38 ± 6 70 ± 5 58 ± 4
Tinh dầu lá thông P. ponderosa có hoạt tính mạnh đối với các chủng nấm thử nghiệm.
Tinh dầu lá thông P. resunosa có hoạt tính ức chế yếu đối với chủng F. culmorum nhưng thể hiện hoạt tính mạnh đối với 2 chủng nấm còn lại.
Tinh dầu lá thông P. strobus có hoạt tính kém nhất trong các loại tinh dầu thử nghiệm trên cả 3 chủng nấm.
Năm 2004, tác giả Motiejūnaitė và Pečiulytė công bố kết quả nghiên cứu khả năng diệt nấm của tinh dầu lá thông P. sylvestris để nâng cao chất lượng không khí.