Có nhiều phương pháp để cô lập α-pinen. Các phương pháp cô lập có thể là chưng cất phân đoạn tinh dầu thông, sau đó tinh chế sản phẩm, thực hiện phản ứng nitroso, sản phẩm dẫn xuất của nitrosoclorur được phân giải bằng cách đun với anilin trong dung dịch alcol. Sản phẩm thu được là hỗn hợp tiêu triền của α-pinen.
Hiện nay, còn có phương pháp sắc ký để tinh chế α-pinen. 1.4.3.5.1 Chưng cất phân đoạn
Để ly trích d-α-pinen, có thể sử dụng tinh dầu thông Hy Lạp làm nguyên liệu. Đầu tiên, làm nóng tinh dầu với KOH, chưng cất hơi nước. Sản phẩm thu được ly trích với MeONa.
31
Đối với l-α-pinen, nguyên liệu sử dụng là tinh dầu thông Pháp. Tinh dầu được chế hoá với muối carbonat của kim loại kiềm, sau đó chưng cất phân đoạn lại, thu lấy phân đoạn chính ở khoảng 156 oC tại 760 mm Hg.
1.4.3.5.2 Phản ứng nitroso
Theo Tilden, để cô lập dl-α-pinen, phản ứng nitroso thường được sử dụng. Đầu tiên, người ta điều chế dẫn xuất nitrosoclorur của pinen. Sản phẩm dl- được phân hủy để cho trở lại pinen bằng cách đun với anilin trong dung môi alcol. Sản phẩm pinen thu được luôn ở dạng không quang hoạt [32].
Một phương pháp khác để thu được α-pinen không quang hoạt là phân huỷ xantat metilpinocamphil (m=60.5-61 oC) bằng cách đun ở 170- 190 oC (theo Tschugaev).
1.4.3.5.3 Sắc ký
Sắc ký bản mỏng
Attaway, Barabas và Worford sử dụng sắc ký bảngmỏng với hai loại bản mỏng silica gel G và alumin oxid G để tiến hành đo Rf của một số monoterpen, sesquiterpen, azulen… Các hidrocarbon này được giải ly trong hexan.
Bảng 1.11: Kết quả giá trị Rf đo được của một số monoterpen
Hợp chất Silica gel Alumin
Camphen 0.83 0.95 ∆-3-Caren 0.85 0.95 p-Cimen 0.67 0.89 p-Isopropeniltoluen 0.62 0.84 d-Limonen 0.76 0.93 2,4(8)-Mentadien 0.76 0.93
32 β-Mircen 0.74 0.92 α-Ocimen 0.71 0.91 β-Ocimen 0.71 0.91 β-Phelandren 0.79 0.93 α-Pinen 0.90 0.96 β-Pinen 0.88 0.95 α-Pironen 0.80 0.94 β-Pironen 0.80 0.94 Sabinen 0.75 0.93 Terpinolen 0.75 0.92 α-Terpinen 0.76 0.93 γ-Terpinen 0.76 0.93 α-Tujen 0.80 0.95 Verbenen 0.81 0.95
Các hidrocarbon cho giá trị Rf rất cao.
Các giá trị Rf gần như bằng nhau ở hầu hết các monoterpen.
Các hidrocarbon thường cho giá trị Rf cao đối với silica gel thông thường. Hầu như không thể tách được các hidrocarbon riêng lẻ trong hỗn hợp các hidrocarbon, ngay cả khi thay đổi các dung môi giải ly. Để có thể cô lập từng cấu phần trong hỗn hợp, người ta dựa vào khả năng tạo phức của các hidrocarbon có nối đôi C=C với kim loại, nhất là đối với ion Ag+. Khi đó, người ta thêm ion Ag+ vào pha tĩnh của cột sắc ký để tăng thời gian lưu của các alken. Bằng phương pháp này, không những có thể tách các alken ra khỏi alkan mà còn có thể tách các alken với nhau dựa trên khả năng tạo nối
33
của chúng với pha tĩnh, từ đó tăng hoặc giảm thời gian lưu. Cách thức tiến hành bao gồm các giai đoạn: pha AgNO3 trong metanol hoặc acetonitril, xử lý silica gel với dung dịch vừa pha, sau đó làm bay hơi hoặc nung nóng để làm khô [25,26].
Thường áp dụng phương pháp này để cô lập các cấu phần α- và β-pinen trong tinh dầu thông. Phương pháp xử lý bản mỏng silica gel được đề nghị như sau [26]:
Ngâm tẩm bảng silica gel trong dung dịch nước của nitrat bạc AgNO3 nồng độ 12.5%. Do nước làm giảm hoạt độ của silica gel nên sau khi tẩm ion Ag+, cần sấy bảng ở 80-110 oC trong 1-2 h. Quá trình ngâm và sấy bảng cần thực hiện ở nơi ít ánh sáng để tránh sự oxid hoá Ag+.
Sắc ký cột:
Phương pháp sắc ký cột để cô lập pinen cũng được tiến hành dựa trên nguyên tắc trên. Cách chuẩn bị cột sắc ký có ion Ag+ như sau:
45 g AgNO3 được pha trong 350 ml nước, thêm vào 300 g silica gel. Hỗn hợp này được làm bay hơi nước trong bình cô quay, sau đó nung hoặc sấy đến khi khối lượng không đổi ở 130 oC. Theo Andersen và Syrdal, hỗn hợp silica gel có thêm AgNO3 được cô quay ở 70 oC trong 12 h rồi nung ở 80 oC trong 6 h tại áp suất 0.13 mmHg hoặc sấy trong lò ở 12 0 oC trong 8 g để làm khô hoàn toàn [29].
Nếu sử dụng chất hấp phụ là alumin trung tính, cũng có thể thêm vào AgNO3 bằng cách tương tự. 125 g AgNO3 được hoà tan trong 380 ml nước, thêm từ từ 500 g alumin, khuấy đều. Làm khô hỗn hợp bằng cách cô quay chân không tại nhiệt độ 110- 130 oC. Khi hỗn hợp đã khô hoàn toàn, hoạt hoá lại alumin trong 15 phút, tại nhiệt độ 130 oC trong môi trường chân không sâu.
Hogg và Lawrence đã thực hiện việc cô lập các cấu phần trong tinh dầu bạc hà lục Mentha cardiaca bằng phương pháp chưng cất kết hợp với sắc ký cột [38]. Phân đoạn có nhiệt độ sôi thấp nhất của tinh dầu được tách ra bằng cột chưng cất có 35 mâm lý thuyết và được chưng cất lại, tách thành 10 phân đoạn. Phân đoạn thứ 9 (3 g) được sắc ký với alumin hoạt độ I (tỷ lệ 1:40) bằng dung môi giải ly tuyến tính (eter dầu hoả
34
30-60, dietil eter, metanol) thành 60 phân đoạn. Sử dụng 10 phân đoạn đầu sắc ký lại với alumin có tẩm AgNO3 15 % (tỷ lệ 1:40) với dung môi giải ly như trên thành 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml. Sản phẩm thu được bao gồm α-pinen (phân đoạn 9- 12), α-pinen và tujen (phân đoạn 13-14), các hợp chất 1-vinil-5,5- dimetilbiciclo[2.1.1]hexan, camphen, β-pinen và limonen có mặt trong phân đoạn từ 25-28, phân đoạn 30 chứa mircen.
Ngoài ra, borat bạc cũng có thể được tẩm lên silica gel để đóng vai trò tác nhân tạo phức để tách các hỗn hợp hidrocarbon có trong tinh dầu.
Sắc ký khí-lỏng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Một lượng nhỏ α-pinen có thể được tinh chế bằng GLC với helium là khí mang. Cột được nhồi với chất mang Chromosorb có 20 % polypropilen. Tiến hành sắc ký tại nhiệt độ cột là 90 oC.
1.4.3.6 Sinh tổng hợp
Cả α-và β-pinen đều được tổng hợp từ pirophosphat geranil, thông qua cơ chế hoàn hoá pirophosphat linalil [28,29,30].
Cơ chế sinh tổng hợp pinen:
35 +
-[H+] -[H+]
Hình 1.5. Cơ chế sinh tổng hợp pinen
Tuỳ vào vị trí H+ bị khử mà sản phẩm tạo thành có thể là đồng phân α- hoặc β- pinen
1.4.3.7 Công dụng
Công dụng chủ yếu của α-pinen là làm nguyên liệu để tổng hợp borneol, camphor và terpineol. α-Pinen cũng là một cấu phần quan trọng trong các tinh dầu nhân tạo.
Phân đoạn có chứa α- và β-pinen được dùng rộng rãi trong công nghiệp dung môi, cũng như làm chất thơm phụ trợ cho các sản phẩm như muối tắm, chất xịt phòng, chất diệt côn trùng, chất khử trùng…. Gần đây, người ta còn dùng α-pinen để tổng hợp dầu thông nhân tạo.
36
2.1 Nguyên liệu
Nhựa và lá thông được thu hoạch từ rừng thông ba lá 26 năm tuổi, trồng tại lâm trường Bảo Lâm, huyện Bảo Lâm, tỉnh Lâm Đồng.
Nhựa thông sau khi thu hoạch xong, cho vào bao nilon, cột chặt và được ly trích tinh dầu trong thời gian tối đa 7 ngày sau khi thu hoạch.
Lá thông tươi sau khi thu hái được bảo quản lạnh và ly trích tinh dầu trong vòng 5 ngày khi lá còn tươi.
Cành thông dùng để ly trích là những cành non.
Lá và cành thông được cắt nhỏ và bảo quản lạnh, mỗi lần ly trích chỉ lấy ra một lượng nhỏ vừa đủ sử dụng để tránh việc bay hơi tinh dầu.
37
Hình 2.2. Nhựa thông ba lá
2.2 Giải phẫu học tuyến tinh dầu
Bộ phận chứa tinh dầu của cành và lá thông được xác định tại bộ môn Sinh thái và Sinh học tiến hoá, khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, TPHCM.
2.2.1 Bộ phận chứa tinh dầu ở lá
Kết quả giải phẫu học tuyến tinh dầu ở lá thông ba lá cho thấy các mô tạo ra tinh dầu ở lá có dạng tế bào tiết.
38
Hình 2.3. Tuyến tinh dầu ở lá thông dưới kính hiển vi phóng đại 100 lần.
Hình 2.4. Tuyến tinh dầu ở lá thông dưới kính hiển vi phóng đại 400 lần.
2.2.2 Bộ phận chứa tinh dầu ở cành
Kết quả giải phẫu học tuyến tinh dầu ở cành thông cho thấy tinh dầu được chứa trong các xoang tiết.
Hình 2.5. Tuy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3 Khảo sát sự ly trích tinh d
Sơ đồ 2.1. Quy trình ly trích tinh d
39
Hình 2.5. Tuyến tinh dầu ở cành thông.
ly trích tinh dầu thông ba lá
40
2.3.1 Khảo sát sự ly trích tinh dầu nhựa thông
2.3.1.1 Khảo sát khối lượng tinh dầu theo lượng nước thêm vào nguyên liệu
Sự hiện diện của nước là cần thiết trong quá trình ly trích tinh dầu nhựa thông vì khi đun nóng, nước sẽ lôi cuốn các cấu phần dễ bay hơi, làm cho tinh dầu thoát ra dễ dàng hơn. Hơn nữa, do lượng nước trong nhựa thông là rất ít, vì vậy cần thêm nước vào nguyên liệu để tránh hiện tượng cháy khét. Tuy nhiên, nếu thêm quá dư nước cũng không có lợi, vì sẽ làm thời gian ly trích kéo dài, làm tăng năng lượng cung cấp cho quá trình ly trích.
Cho 15 g nhựa thông vào bình cầu 2000 ml với các thể tích nước xác định, chưng cất theo phương pháp đun nóng truyền thống (CHHD) trong 60 phút, cân khối lượng tinh dầu thu được. Kết quả được thể hiện trong bảng 2.1
Bảng 2.1: Kết quả khảo sát khối lượng tinh dầu nhựa thông theo thể tích nước chưng cất
Thể tích nước (ml) 200 400 600 800 1000 1200
Khối lượng tinh dầu (g) 1.19 2.00 2.13 2.38 2.38 2.38
Đồ thị 2.1. Khối lượng tinh dầu nhựa thông theo thể tích nước thêm vào 0 0.5 1 1.5 2 2.5 200 400 600 800 1000 1200 K h ố i lư ợ n g t in h d ầ u ( g ) Thể tích nước (ml)
41
Với thể tích nước thêm vào là 200 ml, khi chưng cất được 45 phút, có hiện tượng nhựa thông trong bình cầu bị khét, chứng tỏ lượng nước thêm vào là chưa đủ. Khi tăng thể tích nước thêm vào, chúng tôi nhận thấy khối lượng tinh dầu thu được tăng dần, tuy nhiên thời gian đun nóng trước khi tinh dầu ngưng tự cũng tăng theo. Đến khi thể tích nước thêm vào đạt 800 ml, chúng tôi nhận thấy khối lượng tinh dầu nhựa thông thu được không tăng nữa. Vì vậy, chúng tôi chọn thể tích nước thêm vào tối ưu là 800 ml.
2.3.1.2 Khảo sát khối lượng tinh dầu nhựa thông theo thời gian ly trích
Thời gian ly trích là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khối lượng và chất lượng tinh dầu. Nếu thời gian ly trích quá ngắn sẽ không thể lôi cuốn hết được lượng tinh dầu có trong nguyên liệu. Nhưng nếu kéo dài thời gian ly trích quá lâu, các cấu phần không bền nhiệt trong tinh dầu có thể bị phá hủy, làm ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu. Vì vậy, cần phải chọn lựa một thời gian ly trích tối ưu để đạt đến hiệu suất ly trích tối ưu..
Để khảo sát thời gian ly trích, chúng tôi sử dụng hai phương pháp đun nóng bao gồm:
• Phương pháp đun nóng truyền thống.
• Phương pháp chiếu xạ vi sóng.
2.3.1.2.1 Phương pháp chưng cất hơi nước đun nóng truyền thống (CHHD)
Tinh dầu nhựa thông được ly trích bằng phương pháp CHHD với bộ Clevenger (ống gạn tinh dầu nhẹ). Sử dụng mỗi lần 15 g nhựa thông nghiền nhỏ, thêm 800 ml nước. Tiến hành chưng cất từ 30- 135 phút để xác định thời gian ly trích tối ưu.
42
Bảng 2.2: Khối lượng tinh dầu nhựa thông theo thời gian chưng cất bằng phương pháp CHHD
Thời gian (phút) 30 45 60 75 90 105 120 135
Khối lượng (g) 0.84 1.75 2.38 2.69 2.70 2.65 2.64 2.59
Đồ thị 2.2. Khối lượng tinh dầu nhựa thông theo thời gian chưng cất bằng phương pháp CHHD
Hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu (%) được tính bằng tỷ số giữa khối lượng tinh dầu thu được trên khối lượng nguyên liệu sử dụng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tinh dầu nhựa thông ly trích bằng phương pháp CHHD là chất lỏng trong suốt, không màu, có mùi tự nhiên. Khối lượng tinh dầu tăng theo thời gian chưng cất, sau 75 phút khối lượng tinh dầu thu được không tăng nữa nên chúng tôi chọn thời gian ly trích tối ưu là 75 phút với hàm lượng đạt cao nhất là 18.00 %.
2.3.1.2.2 Phương pháp MIHD
Sử dụng 15 g nhựa thông nghiền nhỏ, thêm 800 ml nước cho vào bình cầu 2000 ml. Chiếu xạ vi sóng với công suất 750 W từ 5-17 phút để xác định thời gian chiếu xạ tối ưu. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 30 45 60 75 90 105 120 135 K h ố i lư ợ n g ( g ) Thời gian (phút)
43
Bảng 2.3: Khối lượng tinh dầu nhựa thông theo thời gian chưng cất bằng phương pháp MIHD
Thời gian (phút) 5 7 9 11 13 15 17
Khối lượng (g) 0.41 0.97 1.28 1.33 1.82 2.40 2.23
Đồ thị 2.3. Khối lượng tinh dầu nhựa thông theo thời gian chiếu xạ bằng phương pháp MIHD
Tinh dầu nhựa thông ly trích bằng phương pháp chưng cất hơi nước có chiếu xạ vi sóng là chất lỏng trong suốt, không màu, có mùi giống như tự nhiên. Hàm lượng tinh dầu đạt cao nhất là 16.03 % sau 15 phút chiếu xạ vi sóng
2.3.1.2.3 So sánh hàm lượng tương đối giữa hai phương pháp
Bảng 2.4: So sánh hàm lượng và thời gian ly trích của hai phương pháp
Phương pháp ly trích Thời gian (phút) Hàm lượng (%)
CHHD 75 18.00 MIHD 15 16.02 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 5 7 9 11 13 15 17 K h ố i lư ợ n g ( g ) Thời gian (phút)
44
Đồ thị 2.4. So sánh hàm lượng và thời gian ly trích của hai phương pháp Từ các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy:
Phương pháp CHHD và MIHD cho hàm lượng tinh dầu có sự chênh lệch lớn (gần 2 %), tuy nhiên phương pháp MIHD có thời gian ly trích ngắn hơn.
Cả hai phương pháp đều cho tinh dầu không màu, trong suốt, mùi giống tự nhiên.
2.3.2 Khảo sát sự ly trích tinh dầu lá thông
2.3.2.1 Khảo sát khối lượng tinh dầu lá thông theo lượng nước thêm vào nguyên liệu liệu
Thông là loại thực vật có lá kim. Hình dạng lá này khiến cho lượng nước chứa trong lá thông khá ít, không đủ để lôi cuốn hết lượng tinh dầu có trong các tế bào. Vì vậy, để sự ly trích tiến hành có hiệu quả, chúng tôi nhận thấy phải có sự thêm nước vào nguyên liệu trước khi ly trích.
75 15 18.00 16.02 0 10 20 30 40 50 60 70 80 CHHD MIHD Thời gian Hàm lượng
45
Cho 100 g lá thông đã cắt nhỏ vào bình cầu 2000 ml, thêm vào nguyên liệu các thể tích nước xác định. Chưng cất theo phương pháp CHHD trong 2 giờ, cân khối lượng tinh dầu thu được. Kết quả được thể hiện trong bảng 2.5
Bảng 2.5. Khối lượng tinh dầu lá thông theo thể tích nước thêm vào nguyên liệu
Thể tích nước (ml) 600 800 1000 1200 1400
Khối lượng tinh dầu (g) 0.09 0.13 0.15 0.15 0.14
Đồ thị 2.5. Khối lượng tinh dầu lá thông theo thể tích nước thêm vào nguyên liệu Do lượng nước có sẵn trong nguyên liệu là quá ít nên cần thiết phải có sự thêm nước vào nguyên liệu khi ly trích tinh dầu. Nếu lượng nước thêm vào ít thì sự ly trích tinh dầu cũng không hiệu quả. Tuy nhiên, thêm vào nguyên liệu quá nhiều nước sẽ làm kéo dài thời gian ly trích, gây ra hao phí năng lượng. Vì vậy, chúng tôi chọn lượng nước tối ưu để thêm vào khi ly trích tinh dầu lá thông ba lá là 1000 ml.
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 600 800 1000 1200 1400 K h ố i lư ợ n g t in h d ầ u ( g ) Thể tích nước (ml)
46
2.3.2.2 Khảo sát khối lượng tinh dầu lá thông theo thời gian chưng cất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.2.2.1 Phương pháp CHHD
Tinh dầu lá thông được ly trích bằng phương pháp CHHD với bộ Clevenger