PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3.6. Nghiên cứu hoạt tính sinh học trong nguyên liệu ban đầu
Sau khi thu được cao tổng và cao nước, sẽ tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế enzyme α-glucosidase, khả năng kháng oxy hóa và khả năng kháng khuẩn.
Cân 100g nguyên liệu bột lá Cóc đỏ được xử lý theo sơ đồ quy trình điều chế cao theo sơ đồ 2.2 để thu nhận bán thành phẩm cao chiết nước với cồn
2.3.6.1. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase
Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase được đánh giá theo phương pháp của Apostolidis và cộng sự. Thí nghiệm được thực hiện trên cao cồn và cao nước theo bố trí thí nghiệm ở bảng 2.2.
Bảng 2. 2: Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase Mẫu thí nghiệm Nồng độ (µg/ml)
0 10 50 100 200
Cao cồn E1 E2 E3 E4 E5
Cao nước F1 F2 F3 F4 F5
Acarbose G1 G2 G3 G4 G5
Quy trính xác định khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của dịch chiết lá Cóc đỏ được trình bày theo sơ đồ 2.6.
Sơ đồ 2. 6: Phản ứng ức chế enzyme α-glucosidase
Thuyết minh quy trình
Một hỗn hợp phản ứng chứa 60 µL dung dịch đệm phosphate 100 mM ( pH=6.8), 20 µL mẫu thí nghiệm được pha trong dung dịch DMSO tại các nồng độ khác nhau theo bảng bố trí thí nghiệm 2.2 và 100 µL dung dịch p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside 200 µM (trong dung dịch đệm phosphate 100 mM), được ủ trong các đĩa 96 giếng ở 37
0C trong 10 phút. Tiếp theo, thêm vào hỗn hợp 20 µL dung dịch α-glucosidase 0.3 U/mL pha trong đệm phosphate. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37 0C trong 10 phút. Sau đó, phản ứng được dừng bằng cách thêm 20 µL dung dịch NaOH 50 mM. Độ hấp thụ của
Enzyme α-glucosidase Mẫu thí nghiệm
Lắc đều
Ủ 20 phút, ở nhiệt độ phòng
Lắc đều Ủ ở nhiệt độ phòng
Đo quang phổ ở 405 nm
Tính toán
Giá trị I%
p-nitrophenyl-α-D glucosidase
mẫu thí nghiệm được đo ở bước sóng 405 nm và được so sánh với mẫu đối chứng bằng cách thay thế 20 µL dung dịch mẫu thí nghiệm bằng dung dịch đệm phosphate.
Acarbose đã được sử dụng làm mẫu đối chứng dương.
Xử lý kết quả:
% Ức chế α-glucosidase= x100 A
A A
control sample control−
Trong đó:
Acontrol: độ hấp thụ của chứng âm Asample:độ hấp thụ của mẫu thử
Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase được đánh giá bằng giá trị IC50. Giá trị IC50 của mỗi mẫu được tính dựa trên phương pháp hồi quy từ đồ thị giữa % ức chế enzyme α-glucosidase với nồng độ chất ức chế.
2.3.6.2. Khảo sát khả năng kháng oxy hóa
Hoạt tính kháng oxy hóa được đánh giá dựa trên khả năng đánh bắt gốc tự do DPPH• theo phương pháp được mô tả bởi Goldschmidt và Ren. Thí nghiệm được thực hiện trên cao cồn và cao nước theo bố trí thí nghiệm ở bảng 2.3.
Bảng 2. 3: Khảo sát sự kháng oxy hóa Mẫu thí
nghiệm
Nồng độ (µg/ml) 0 10 50 100 200 Cao cồn E1 E2 E3 E4 E5 Cao nước F1 F2 F3 F4 F5
Acid ascorbic
G1 G2 G3 G4 G5
Quy trính xác định khả năng đánh bắt gốc tự do DPPH• của dịch chiết lá Cóc đỏ được trình bày theo sơ đồ 2.9
Sơ đồ 2. 7: Quy trình thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH•
Thuyết minh quy trình
Tiến hành lấy 100 µL dung dịch mẫu thí nghiệm được pha trong ethanol tại các nồng độ khác nhau theo bố trí thí nghệm bảng 2.3 (từ 10 đến 200 µg/mL) và 100 µL dung dịch DPPH• 0.2 mM, được trộn đều và ủ trong bóng tối trong 30 phút tại nhiệt độ phòng. Sau đó, mẫu thí nghiệm được đem đi đo độ hấp phụ tại bước sóng 517 nm
Xử lý kết quả:
Hoạt tính chống oxy hóa được tính theo công thức:
DPPH• (%) = 100 × (ODc − ODm) ODc
Trong đó:
ODc: giá trị mật độ quang OD của chứng âm ODm: giá trị mật độ quang OD của mẫu thử
Từ kết quả hoạt tính kháng oxy hóa và nồng độ mẫu, dựng đường chuẩn. Dựa vào đường chuẩn tính được IC50 (khả năng đánh bắt 50% DPPH• của mẫu). Giá trị IC50
càng thấp tương ứng với khả năng kháng oxy hóa càng cao và ngược lại.
Mẫu thí nghiệm
Dung dịch mẫu
Dung dịch sau ủ
Đo OD 512mm
DPDH (O,2mm)
Sơ đồ 2. 8: Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn 2.3.6.3. Khảo sát khả năng kháng khuẩn
Khả năng kháng khuẩn được đánh giá theo phương pháp của Mahesh và cộng sự, được xác định dựa vào sự hình thành vòng kháng khuẩn được tạo ra trên đĩa petri. Thí nghiệm được thực hiện trên cao cồn và cao nước theo bố trí thí nghiệm ở bảng 2.4.
Bảng 2. 4. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn từ cao chiết từ lá Cóc đỏ
Quy trính xác định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá Cóc đỏ được trình bày theo sơ đố 2.10.
Cao chiết
Nồng độ (mg/ml)
50 100 150 200
Cồn M50 M100 M150 M200
Nước N50 N100 N150 N200
Ampicilin L1 L2 L3 L4
Đổ môi trường thạch MHA
Tran vi khuẩn trên đĩa petri
Đục lỗ 2mm
Bơm dung dịch mẫu vào giếng (µl)
Ủ ở 37Oc/ 24 giờ
Thuyết minh quy trình
Dịch vi khuẩn (E.Coli và Salmonella) với nồng độ 108 CFU/ml được trải đều trên bề mặt đĩa môi trường MHA và được để khô trong 15 phút ở nhiệt độ phòng trong điều kiện vô trùng trước khi đục giếng. Mẫu thí nghiệm tại các dãy nồng độ khác nhau theo bố trí thí nghiệm bảng 2.5 được bơm vào các giếng trên đĩa thạch. Sau đó, mẫu được ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ 37 0C. Kháng sinh thương mại ampicillin được sử dụng như chất đối chứng dương trong thí nghiệm.
Xử lý kết quả:
Khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá Cóc đỏ dựa vào đường kính vòng vô khuẩn (mm) trên đĩa petri.