Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3. Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp đánh giá thí nghiệm đồng ruộng
* Thí nghiệm đánh giá, chọn lọc dòng đậu tương đột biến
Toàn bộ lượng hạt sau xử lý chiếu xạ được gieo trồng ngoài đồng ruộng (các cá thể M1). Tiến hành theo dõi thường xuyên quá trình sinh trưởng phát triển, đồng thời phát hiện các dạng biến đổi từ khi gieo đến khi thu hoạch và phát hiện các biến dị mục tiêu. Thu riêng những cây đặc biệt theo từng cá thể để trồng thành hàng ở vụ sau. Toàn bộ số cây còn lại được thu hỗn để gieo ở vụ tiếp theo.
Thế hệ M2, nghiên cứu mức độ phân ly tính trạng từ thế hệ M1 sang thế hệ M2, đồng thời tiếp tục phát hiện các biến dị mục tiêu. Thu riêng những cây đặc biệt theo từng cá thể để trồng thành hàng ở vụ sau. Toàn bộ số cây còn lại được thu hỗn 1 quả/cây để gieo ở vụ tiếp theo.
Thế hệ M3,nghiên cứu mức độ phân ly tính trạng của các biến dị đặc biệt thu được từ thế hệ M2 sang thế hệ M3, đồng thời tiếp tục phát hiện các biến dị mục tiêu.
Thu riêng những cây đặc biệt theo từng cá thể để trồng thành hàng ở vụ sau.
Từ thế hệ M4, áp dụng phương pháp chọn lọc phả hệ. Gieo hạt thu được từ cây M3 thành hàng (các dòng M4). Đánh giá trực quan các dòng M4 thông qua các tính trạng dễ quan sát như TGST, chiều cao cây, mức độ nhiễm bệnh, tính chống đổ…. Chọn cá thể tốt nhất trong các dòng tốt. Ở vụ sau, trồng riêng biệt thành dòng M5. Quá trình chọn lọc được lặp lại đến khi đạt độ thuần di truyền mong muốn. Các dòng tốt và đồng đều được thu hỗn theo từng dòng để đưa vào thí nghiệm so sánh sơ bộ. Các dòng được chọn từ thí nghiệm so sánh sơ bộ sẽ được đưa vào thí nghiệm so sánh cơ bản. Chọn dòng tốt từ thí nghiệm so sánh cơ bản gửi tham gia khảo nghiệm Quốc gia.
* Thí nghiệm đánh giá, chọn lọc dòng đậu tương lai
Các chỉ tiêu được theo dõi và đánh giá trực quan ngoài đồng ruộng đối với các tính trạng mang tính định tính. Các tính trạng mang tính định lượng được đo đếm trong phòng trên 30 cây mẫu đối với dòng lai thế hệ F1-2 và 10 cây mẫu đối với dòng lai từ thế hệ F4 trở đi và các giống bố, mẹ.
Áp dụng phương pháp chọn lọc phả hệ (pedigree method). Tiến hành chọn lọc dòng mục tiêu bắt đầu ở thế hệ F2 dựa vào đánh giá trực quan những tính trạng về TGST, chiều cao cây, mức độ nhiễm bệnh hại, tính chống đổ, khối lượng 1000 hạt, màu rốn hạt….
Toàn bộ hạt lai từ mỗi tổ hợp được gieo trồng trong điều kiện đồng ruộng (các cá thể F1), khử bỏ cây tự thụ, thu hỗn theo từng tổ hợp để gieo ở F2. Gieo hạt thu được từ cây F2 thành hàng ở vụ sau (các dòng F3). Đánh giá trực quan các dòng F3 thông qua các tính trạng dễ quan sát như TGST, chiều cao cây, mức độ nhiễm bệnh, tính chống đổ…. Chọn cá thể tốt nhất trong các dòng tốt. Ở vụ sau, trồng riêng biệt thành dòng F4. Quá trình chọn lọc được lặp lại đến khi đạt độ thuần di
truyền mong muốn. Các dòng tốt và đồng đều được thu hỗn theo từng dòng để đưa vào thí nghiệm so sánh sơ bộ. Các dòng được chọn từ thí nghiệm so sánh sơ bộ sẽ được đưa vào thí nghiệm so sánh cơ bản. Chọn dòng tốt từ thí nghiệm so sánh cơ bản gửi tham gia khảo nghiệm Quốc gia.
Số liệu được xử lý trên máy vi tính theo chương trình thống kê exell 2003:
Tính trung bình, hệ số biến động và xác định mức độ trội (D), hệ số di truyền (H)…
- Xác định mức độ trội (D):
D = H X
X F
p p
p
1
Trong đó: F1: Giá trị trung bình của F1
Xp: Giá trị trung bình của bố, mẹ
Hp: Giá trị trung bình của bố, mẹ cao nhất Kết quả:
D = 0 : Di truyền cộng hợp D = 1: Di truyền do tính trội D > 1: Di truyền siêu trội (±) D < 1: Di truyền cộng hợp – trội
- Hệ số di truyền (H) ở quần thể F2 (Mahmud và Kramer, 1951):
H =
V V V V
f p p f
2 2 1
2 2
)
(
Trong đó: V f2: Phương sai của con lai F2
V p1, V p 2: Phương sai của giống bố, mẹ
Giá trị của hệ số di truyền H dao động từ 0 đến 1. Những tính trạng có hệ số di truyền lớn (H tiến tới 1) thì hiệu quả chọn lọc càng cao. Ngược lại, những tính trạng có hệ số di truyền nhỏ (H tiến tới 0) thì hiệu quả chọn lọc càng thấp. Như vậy, trong dòng thuần do các cá thể có cùng kiểu gen nên toàn bộ sự sai khác giữa các cá thể hoàn toàn là do các yếu tố ngoại cảnh (H=0).
* Thí nghiệm so sánh cơ bản các dòng đậu tương triển vọng
Theo Quy phạm khảo nghiệm số 10TCN 339-2006 và QCVN 01-58:
2011/BNNPTN. Cây theo dõi được xác định khi cây có 4 – 5 lá thật. Mỗi lần nhắc lại 10 cây. Lấy 5 cây liên tiếp ở 2 hàng giữa luống, trừ 5 cây đầu hàng.
* Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp đánh giá
Các chỉ tiêu theo dõi, phương pháp đánh giá các đặc điểm hình thái và nông sinh học của các dòng giống đậu tương theo Quy phạm khảo nghiệm 10 TCN 339- 2006 và QCVN 01-58: 2011/BNNPTN, trong đó bao gồm:
- Đặc điểm hình thái của các mẫu giống: Hình dạng lá, dạng cây, kiểu sinh trưởng, màu sắc thân mầm, hoa, lông, vỏ quả, vỏ hạt, rốn hạt.
- Đặc điểm sinh trưởng, phát triển của các mẫu giống:
Thời gian từ gieo đến mọc (ngày): Quan sát toàn bộ số cây trên ô ở giai đoạn nảy mầm. Số ngày mọc được tính từ khi mọc đến khoảng 50% số cây trên ô mọc 2 lá mầm.
Thời gian từ gieo đến ra hoa (ngày): Quan sát toàn bộ số cây trên dòng, ô ở giai đoạn ra hoa. Số ngày ra hoa được tính từ khi mọc đến khoảng 50% số cây trên ô có ít nhất 1 hoa nở.
TGST (ngày): Quan sát toàn bộ số cây trên ô ở giai đoạn chín. TGST được tính từ khi gieo đến khoảng 90% số cây trên dòng, ô có vỏ quả chuyển màu chín đặc trưng.
Chiều cao cây (cm): Đo từ đốt lá mầm đến đỉnh sinh trưởng của thân chính của 10 cây mẫu ở giai đoạn thu hoạch rồi tính chiều cao trung bình trên cây.
Chiều cao đóng quả (cm): Đo từ đốt lá mầm đến chùm quả đầu tiên của thân chính của 10 cây mẫu ở giai đoạn thu hoạch rồi tính chiều cao đóng quả trung bình trên cây.
Số đốt trên thân (đốt): Đếm toàn bộ số đốt trên thân chính (tính từ đốt 2 lá đơn) của 10 cây mẫu ở giai đoạn thu hoạch rồi tính số đốt trung bình trên cây.
Số đốt mang quả trên thân (đốt): Đếm toàn bộ số đốt mang quả trên thân chính của 10 cây mẫu ở giai đoạn thu hoạch rồi tính số đốt trung bình trên cây.
Số cành cấp 1 trên cây (cành): Đếm toàn bộ số cành cấp 1 mọc ra từ thân chính của 10 cây mẫu ở giai đoạn thu hoạch rồi tính số cành cấp I mang quả trung bình trên cây.
Số cây thực thu trên ô (cây): Đếm toàn bộ số cây thực thu mỗi ô thí nghiệm.
Số quả/cây (quả): Đếm tổng số quả trên 10 cây mẫu ở giai đoạn thu hoạch rồi tính số quả trung bình trên cây, lấy một chữ số sau dấu phẩy.
Số quả chắc/cây (quả): Đếm tổng số quả chắc trên 10 cây mẫu ở giai đoạn thu hoạch rồi tính số quả chắc trung bình trên cây, lấy một chữ số sau dấu phẩy.
Số quả 1 hạt/cây (quả): Đếm tổng số quả 1 hạt trên 10 cây mẫu ở giai đoạn thu hoạch rồi tính số quả 1 hạt trung bình trên cây, lấy một chữ số sau dấu phẩy.
Số quả 3 hạt/cây (quả): Đếm tổng số quả 3 hạt trên 10 cây mẫu ở giai đoạn thu hoạch rồi tính số quả 3 hạt trung bình trên cây, lấy một chữ số sau dấu phẩy.
Khối lượng hạt khô/cây (g): Cân khối lượng tổng số hạt khô của số cây mẫu/lần nhắc ở độ ẩm 12% rồi tính khối lượng trung bình trên cây, lấy 2 chữ số sau dấu phẩy.
Khối lượng 1.000 hạt khô (g): Xác định khối lượng 1000 hạt khô ở độ ẩm 12%. Hỗn hợp toàn bộ số hạt của số cây mẫu ở 3 lần nhắc rồi cân 3 mẫu, mỗi mẫu 1.000 hạt, sau đó tính khối lượng 1.000 hạt trung bình của mỗi công thức.
Năng suất hạt khô thực tế (tấn/ha): Thu riêng hạt khô sạch của từng ô, tính năng suất toàn ô (gồm cả khối lượng hạt của 10 cây mẫu) ở độ ẩm 12% và quy ra năng suất trên 1 ha.
- Đánh giá về khả năng chống chịu (theo Quy phạm khảo nghiệm 10 TCN 339- 2006 và QCVN 01-58: 2011/BNNPTN):
Sâu cuốn lá - Lamprosema indicata: Điều tra ít nhất 10 cây đại diện theo phương pháp 5 điểm chéo góc ở giai đoạn trước thu hoạch. Tỷ lệ lá bị hại (%) = Số lá bị cuốn/tổng số lá điều tra x 100.
Sâu đục quả - Eitiella zinekenella (%): Điều tra ít nhất 10 cây đại diện theo phương pháp 5 điểm chéo góc ở giai đoạn trước thu hoạch. Tỷ lệ quả bị hại (%) = Số quả bị hại/Tổng số quả điều tra x 100.
Giòi đục thân - Melanesgromyza sojae: Điều tra ít nhất 10 cây đại diện theo phương pháp 5 điểm chéo góc ở giai đoạn cây con. Tỷ lệ cây bị hại (%) = Số cây bị hại/Tổng số cây điều tra x 100.
Bệnh lở cổ rễ - Rhizoctonia solani Kunh: Điều tra trên toàn bộ các cây/ô ở giai đoạn cây con (sau mọc 7 ngày). Tỷ lệ cây bị bệnh (%) = Số cây bị bệnh/tổng số cây điều tra x 100.
Bệnh gỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi Sydow), bệnh sương mai (Peronospora manshurica), bệnh đốm nâu (Septoria glycines Hemmi): Điều tra ít nhất 10 cây đại
diện theo phương pháp 5 điểm chéo góc ở giai đoạn ra hoa rộ - vào chắc. Đánh giá mức độ nhiễm bệnh theo thang điểm phân cấp sau:
Điểm 1: Rất nhẹ (<1% diện tích lá bị hại) Điểm 3: Nhẹ (1% đến 5 % diện tích lá bị hại)
Điểm 5: Trung bình (>5% đến 25% diện tích lá bị hại) Điểm 7: Nặng (> 25%-50% diện tích lá bị hại)
Điểm 9: Rất nặng (>50% diện tích lá bị hại)
Bệnh đốm nâu, bệnh sương mai: Điều tra ít nhất 10 cây đại diện theo phương pháp 5 điểm chéo góc khi xuất hiện bệnh và đánh giá mức độ nhiễm bệnh theo thang điểm phân cấp như đối với bệnh gỉ sắt.
Bệnh phấn trắng (Erysiphe communis Grev.): Điều tra ít nhất 10 cây đại diện theo phương pháp 5 điểm chéo góc khi xuất hiện bệnh và đánh giá mức độ nhiễm bệnh theo thang điểm phân cấp sau:
Điểm 1: Không nhiễm (<5% số cây có vết bệnh) Điểm 2: Nhiễm nhẹ (6 - 25 % số cây có vết bệnh) Điểm 3: Nhiễm trung bình (26 -50% số cây có vết bệnh) Điểm 4: Nhiễm nặng (51 – 75% số cây có vết bệnh) Điểm 5: Nhiễm rất nặng (>76% số cây có vết bệnh)
Tính chống đổ: Đếm số cây trên ô ở giai đoạn trước thu hoạch và đánh giá theo thang điểm sau:
Điểm 1: Không đổ (Hầu hết các cây đều đứng thẳng) Điểm 2: Nhẹ (<25% số cây bị đổ rạp)
Điểm 3: Trung bình (25-50% số cây bị đổ rạp, các cây khác nghiêng ≥45%) Điểm 4: Nặng (51-75% số cây bị đổ rạp)
Điểm 5: Rất nặng (>75% số cây bị đổ rạp)
Tính tách quả:Điều tra ít nhất 10 cây đại diện theo phương pháp 5 điểm chéo góc ở giai đoạn quả và hạt chín và đánh giá theo thang điểm sau:
Điểm 1: Không có quả tách vỏ Điểm 2: Thấp (<25% quả tách vỏ)
Điểm 3: Trung bình (25%-50% quả tách vỏ) Điểm 4: Cao (51-75% quả tách vỏ)
Điểm 5: Rất cao (>75% quả tách vỏ)
* Xử lý số liệu: Theo chương trình Excel 2003 và IRRISTAT 5.0
* Thí nghiệm đánh giá tính thích ứng của các dòng giống đậu tương mới: Xác định tính ổn định của giống theo mẫu hình của Eberhart và Russell (1966), trong đó:
Chỉ số môi trường (Ij) được định nghĩa là trung bình một tính trạng nào đó của tất cả các kiểu gen ở một môi trường trừ đi giá trị trung bình chung của tất cả các kiểu gen trên tất cả các môi trường và được tính theo công thức:
Ij = V VL
v
i L
j ij
v
i yij y
1 1 1 , với ∑ Ij = 0
Trong đó: V: Số giống
L: Số địa điểm (năm) thí nghiệm
Hồi quy của từng kiểu gen qua chuỗi môi trường thí nghiệm có khả năng phỏng đoán về tính thích nghi và ổn định của kiểu gen đó theo mô hình tổng quát:
Yij = ài + biIj + δij
Yij: biểu hiện kiểu gen thứ i (ith) ở môi trường thứ j (jth) à: trung bỡnh của tất cả cỏc kiểu gen trờn tất cả mụi trường bi: hệ số hồi quy của kiểu gen ith theo chỉ số môi trường δij: độ lệch từ hồi quy kiểu gen ith ở môi trường jth Ij: chỉ số môi trường
Hệ số hồi quy bi đo lường phản ứng của kiểu gen theo sự thay đổi môi trường và được xác định theo công thức:
bi =
L
j j L
j ij j
I y I
1 2
1 ; bi = 1
Sự thích nghi, ổn định của từng kiểu gen qua các môi trường được mô phỏng bằng phương trình hồi quy: Yij = xi + biIj
Năng suất của các giống có thể dự đoán theo phương trình hồi quy:
Y = Xi + biIj + S2di
Xi: năng suất trung bình của giống qua các môi trường
S2di: chỉ số ổn định của các giống qua các môi trường được xác định theo công thức:
Sdi2 = L dij Sre 2 2
2
Trong đó: S2e : trung bình phương sai của kiểu gen trên tất cả môi trường r: số lần lặp lại của một kiểu gen trên một môi trường
d2ij: độ lệch bình phương trung bình so với đường hồi quy
dij2 =
2
2 1 2 2
j j j
ij j i
j ij
I y I y yL
Theo mô hình trên, kiểu gen có S2di =0 được xem là ổn định, kiểu gen có S2di
≠ 0 thì không ổn định (không phù hợp mô hình). Kiểu gen ổn định và thích nghi rộng có S2di =0 và bi = 1; trường hợp bi > 1 kiểu gen đó thích nghi ở môi trường thuận lợi, ngược lại bi < 1 kiểu gen đó thích nghi điều kiện khó khăn (môi trường không thuận lợi).
Số liệu thu thập được xử lý theo phần mềm ổn định của Nguyễn Đình Hiển (2001).