II. KIẾN NGHỊ
1.6.2. Enzymee Amilase [28]
1,4 glucozit trong mạch polysaccharide, trừ điểm phân nhánh trong amylopectin, để tạo thành maltose. Một đặc điểm nữa của α-amylase là hầu hết như chúng không tác dụng lên tinh bột nguyên thuỷ, nhưng tác dụng thuỷ phân hồ tinh bột rất nhanh.
Khi thuỷ phân tinh bột bằng α-amylase thường xảy ra hai giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Chỉ có một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh.
- Giai đoạn 2: Thuỷ phân tiếp các dextrin phân tử lớn vừa được tạo thành thành các dextrin phân tử thấp hơn, maltose, isomaltose và glucose.
Với α-amylase nói chúng, trong một khoảng thời gian 30-60 phút thì chỉ thuỷ phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp và một ít đường maltose. Tính chất đặc trưng của α-amylase là khả năng dextrin hóa cao. Chính dựa vào tính chất này để xác định hoạt độ của enzymee một cách định tính.
Để làm tương trước nay ta vẫn nhớ vào các bào tử nấm mốc có trong không khí, đất, nước hoặc trên các dụng cụ, rơi vào xôi và phát triển. Hiện tượng này được gọi là sự sử dụng hệ vi sinh vật tự nhiên trong sản xuất.
Có ít nhất 28 loài nấm mốc khác nhau, thuộc vào 11 giống, 2 lớp của hệ thống phân loại. Những loài nấm mốc này thuộc loại hoại sinh.
Trong hệ nấm mốc tự nhiên này, 10 loài sau đây là thường gặp với số lượng lớn trên mốc tương: Mucor mecedo, M. rouxii, Rhizopus nigricans, Aspergillus oryzae, A. flavus, A. niger, Penicillum notatum, P. expansum, Monilia sitophila, Trichoderma lignorum.
Nguyên liệu để sản xuất tương là gạo nếp, đậu nành, muối ăn và nước. Trong hai thứ nguyên liệu chủ yếu thì gạo nếp chiếm 70 – 80%, đậu nành 20 – 30.
Bảng1.7: Tỷ lệ phối trộn để sản xuất tương gạo [15]
Nguyên liệu (kg) Tương Hà Nội loại đặc biệt
Tường Hà Nội loại I Tương Cự Đà và Hà Đông Gạo nếp 33 33 30 Đậu nành 12 7 9 Muối ăn 16 16 13 Nước (lít) 100 100 100
1.7. KỸ THUẬT SẢN XUẤT XÌ DẦU
Ta có 3 phương pháp để sản xuất nước tương là theo phương pháp axit, phương pháp vi sinh vật và phương pháp enzymee.
1.7.1. Phương pháp công nghệ axit [53]
Khô đậu tương hay khô lạc sau khi đã ép dầu thường được đóng thành bánh, cho nên trước khi thuỷ phân phải được bốc rơm, băm nhỏ rồi đem xay.
Nước tương công nghiệp được sản xuất từ bánh dầu chủ yếu bằng phương pháp thủy phân hóa học sử dụng tác nhân xúc tác là HCl. Quy trình công nghệ như sơ đồ sau:
Sơ đồ 1.2: Quy trình sản xuất xì dầu bằng phương pháp axit[53]
Lọc tinh Xay nhỏ Thuỷ phân Để nguội Trung hòa Để lắng Lọc thô Phối chế Xì dầu Đậu tương Thanh trùng Bã Nấu Lọc HCl Na2CO3 Phụ gia
Dùng HCl nồng độ 6-10 N, nhiệt độ 100 – 1800C, thời gian thủy phân 24 đến 72 giờ.
Nếu gia tăng áp suất, sẽ giảm được thời gian.
Do nhiệt độ cao và nồng độ axit đặc, một số axit amin bị phá huỷ trong quá trình thuỷ phân. Tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, các axit amin chứa lưu huỳnh bị mất 10-30%.
Các axit amin chứa nhóm -OH bị phân hủy một phần
Trong thực tế phương pháp thuỷ phân bằng axit đã được ứng dụng trong kỹ nghệ sản xuất nước tương hóa giải còn gọi là xì dầu hay tàu vị yểu. Phương pháp thuỷ phân bằng axit có ưu điểm là rẻ và nhanh, hiệu suất thuỷ phân cao từ 85 đến 90%, thời gian và quy trình sản xuất được rút ngắn, sản phẩm giàu axit amin và dễ bảo quản. Mùi vị nước tương rất ngọt và thơm. Nhược điểm của thuỷ phân bằng axit là: Chi phí năng lượng và thiết bị cao do phải chịu nhiệt và chống axit ăn mòn, việc sử dụng HCl đặc độc hại và gây ô nhiễm môi trường, trong quá trình thuỷ phân ở nhiệt độ cao với xúc tác axit HCl đặc, sẽ làm phân hủy hoàn toàn Trp và một phần Thr, Ser, Met, Cys. Ngoài ra khi nồng độ HCl cao và nhiệt độ cao thường xảy ra phản ứng giữa Cl2 hoặc HCl với glycerol có trong chất béo sinh độc tố 3-MCPD.
Theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam về an toàn thực phẩm, nồng độ tối đa cho phép trong sản phẩm nước tương là 1mg/kg. Ở các nước EU giới hạn hàm lượng 3-MCPD trong nước tương là 0,02ppm.
Chọn công nghệ thay thế [53]
Về nguyên tắc có thể dùng kiềm để thủy phân nhưng tại sao trong công nghiệp rất hạn chế thủy phân protein bằng kiềm.
Sử dụng xúc tác kiềm là NaOH, nồng độ 4-8 N, nhiệt độ 100 - 1100C, thời
nhưng xảy ra hiện tượng racemic hóa. Sản phẩm thủy phân là hỗn hợp racemic D,L- aminoaxit, làm giảm giá trị dinh dưỡng. Ngoài ra còn xảy ra sự oxy hóa một số axit amin khác.
Kiềm xúc tác cho phản ứng tạo lysinoalanine làm giảm lysine trong thực phẩm. Vì vậy trong sản xuất thực phẩm ít khi dùng kiềm để thủy phân protein.
1.7.2. Phương pháp công nghệ vi sinh [53]
Giống như sản xuất nước mắm tận dụng nguồn enzyme ngay trong bản thân nguyên liệu, trong sản xuất tương, người ta sử dụng nguồn enzyme protease do vi sinh vật sinh ra trong quá trình lên men.
Đặc điểm của việc lên men bởi vi sinh vật là hiệu suất thuỷ phân thấp và thời gian thuỷ phân kéo dài. Vì vậy sản phẩm proteolysat là hỗn hợp gồm cả protein, pepton, peptide và axit amin, mà điển hình là tương Bắc.
Các sản phẩm này thường khó bảo quản, do trong sản phẩm có nhiều enzyme khác gây nên sự biến đổi chất lượng vì vậy cần có biện pháp ức chế enzyme hay thanh trùng sản phẩm khi đã thủy phân đạt yêu cầu.
Các enzyme endoprotease của vi khuẩn thủy phân đặc hiệu tại vị trí liên kết các axit amin kỵ nước. Vì vậy các peptides tạo thành sẽ có axit amin kỵ nước ở đầu chuỗi, làm tăng khả năng bị đắng.
Cũng có thể kết hợp công nghệ vi sinh và axit để khắc phục nhược điểm. Phương pháp công nghệ vi sinh có quy trình công nghệ như sau:
Sơ đồ 1.3: Quy trình sản xuất xi dầu bằng phương pháp vi sinh
Đậu tương Nấu áp suất
Làm nguội Xay nhuyễn Cấy Thuỷ phân 1 Thuỷ phân 2 Lọc Tiệt trùng Xì dầu VSV VSV, dd NaCl Bã 3 đến 6 tháng 3 ngày
Để rút ngắn thời gian và ổn định chất lượng sản phẩm thì nên sử dụng chế phẩm enzyme thay thế lên men bằng vi sinh vật.
1.7.3. Phương pháp công nghệ enzymee [53]
Quy trình cơng nghệ sản xuất nước tương bằng phương pháp enzyme như sau: Enzymee được sử dụng gồm protease, cellulase, amylase. Quy trình này có ưu điểm là điều kiện thủy phân ôn hòa, hoàn toàn không sử dụng hóa chất, không làm biến đổi thành phần axit amin ban đầu, nhưng hiệu suất tối đa chỉ đat 70%.
Để khắc phục nhược điểm của cả hai phương pháp trên và bổ sung ưu điểm cho nhau, ta kết hợp thủy phân bằng axit với thủy phân bằng enzyme.
1.7.4. Công nghệ enzymee kết hợp axit [53]
Có thể thực hiện thuỷ phân bằng enzyme trước rồi sau đó mới thuỷ phân bằng axit hoặc thuỷ phân bằng axit rồi sau đó thuỷ phân bằng enzyme. Quy trình được lựa chọn như sau:
Sơ đồ 1.4: Quy trình sản xuất xì dầu bằng phương pháp kết hợp axit Xay nhỏ Đậu tương Thanh trùng Chính pH Thủy phân 1 Thuỷ phân 2 Để nguội Trung hòa Lọc thô Phối chế Lọc tinh Xì dầu Enzyme HCl Na2CO3 Phụ gia Bã Nấu, Lọc NaCl
Việc sử dụng enzyme protease kết hợp axit xúc tác quá trình thủy phân có ưu điểm là giảm thiểu sử dụng hóa chất độc hại, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, rút ngắn thời gian sản xuất. Có thể sản xuất trên hệ thống thiết bị sẵn có.
Bảng 1.8: So sánh các phương pháp sản xuất xì dầu [53]
Phương pháp công nghệ
Đặc điểm công nghệ
Tính chất
sản phẩm Ưu điểm Nhược
điểm Hóa học Axit Tính chất thuỷ phân là HCl đặc Không an toàn do chứa 3-MCPD 1,3-DCP -Chi phí hóa chất trẻ -Thời gian ngắn -Tiêu hao năng lượng, ăn mòn -Ô nhiễm môi trường Kiềm Tác chất thuỷ phân là NaOH đặc Tạo D-aminoaxits Lysinoalanin -Chí phí hóa chất rẻ -Thời gian ngắn Tiêu hao năng lượng, ăn mòn thiết bị Vi sinh Tác nhân thuỷ phân là vi sinh vật An toàn Ít tiêu hao năng lượng Diện tích nhà xưởng lớn Thời gian kéo dài Enzymee Enzymee Tác chất thuỷ phân là enzyme An toàn Mùi vị có thể điều chỉnh -Giảm 80% năng lượng pH trung tính -Thời gian ngắn -Sử dụng nhiều loại enzyme. -Chi phí cao -Hiệu suất tối đa 70% Enzyme kết hợp axit Tác chất thuỷ phân chủ yếu là enzyme -An toàn -Mùi vị không khác biệt -Giảm 70% năng lượng -Thủy phân trên 85% protein Chi phí enzyme cao hơn hóa chất
nghệ tương tự sản xuất từ nguyên liệu đậu nành hạt bằng phương pháp vi sinh, hay thay đổi thành phần nguyên liệu bã dầu đậu nành, bã dầu đậu phụng, kết hợp gluten bột mì...
Mỗi phương pháp sản xuất sẽ cho một sản phẩm có tên gọi khác nhau và mùi vị cũng khác nhau. Tùy vào thị trường mà nhà sản xuất sẽ chọn loại sản phẩm thích hợp nhưng cần phải đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm.
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỦNG NẤM MỐC
2.1.1. Phương pháp vi sinh vật
2.1.1.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật
Phân lập chủng vi sinh vật Aspergillus oryzae từ 2 mẫu được lấy từ cở sở sản xuất nước tương (xì dầu) khác nhau là cở sở sản xuất nước tương Bần ở Yên Nhân, Tỉnh Hưng Yên và nước tương Nam Đàn, Tỉnh Nghệ An.
- Dung cụ phân lập Ống nghiệm : 100 ống Hộp Petry : 60 hộp Bình tam giác 1000 ml: 1 bình 500 ml: 2 bình 250 ml: 20 bình Que trang : 5 que
- Thiết bị
Tủ cấy nấm mốc : 2 tủ Nồi hấp thanh trùng : 1 nồi Tủ sấy : 1 tủ Máy đo pH : 1 máy Tủ nuôi : 2 tủ Tủ nuôi lắc : 2 tủ Cân phân tích : 1 cái Kính hiển vi điện tử : 1 cái Micropipet : 2 cái
- Môi trường nuôi cấy nấm mốc có 2 môi trường chính: a. Môi trường thạch sữa
Thạch : 20 g Sữa : 10 g Nước cất : 1000 ml b. Môi trường Czapek
NaNO3 : 3 g KH2PO4 : 1 g
MgSO47H2O : 0,5 g KCl : 0,5 g FeSO4 : 0,01 g Saccharose : 30 g Cao nấm men: 5 g Thạch : 20 g Nước : 1000 ml
Hình 2.1: Mẫu xôi mốc tương Bần, Yên Nhân, Tỉnh Hưng Yên
2.1.1.2. Tiến hành phân lập
Phân lập 2 mẫu mốc xôi lấy từ cơ sở sản xuất tương Bần và Nam Đàn riêng biệt. Lấy mẫu bằng que cấy từ trong ống nghiệp để vào trong bình tam giác 100 ml đã thanh trùng và thêm nước cất vô trùng vào trong bình tam giác, lắc đều, hút bằng micropipet khoảng 90 µl để vào trong ống Amperdox, rồi pha loãng đến 10-5. Sau đó hút dịch 10 µl nuôi trên bề mặt thạch sữa trong hộp petry. Nuôi ở nhiệt 30oC trong tủ nuôi trong thời gian 48 giờ. Quan sát trên bề mặt thạch sữa, chọn những nấm mốc có mầu vàng da cau, lấy cấy Zigzag trên bề mặt thạch sữa 1 lần nữa và tiếp tục làm như vậy cho đến khi thu được chủng thuần khiết và cấy trên bề mặt thạch nghiêng môi trường Czapek và bao quản ở nhiệt độ -20oC. Thường xuyên cấy chuyển sau 3 tháng.
2.1.1.3. Chọn chủng có hoạt lực enzymee protease cao
Từ 40 chủng nấm mốc phân lập từ mẫu mốc xôi tương Bần và 40 chủng từ mốc xôi tương Nam Đàn cấy chấm điểm trên bề mặt thạch hộp. Sau đó đo đường kính vòng thủy phân (D) do enzymee ngoại bào protease thủy phân protein sữa và đo đường kính khuẩn lạcd(d). Nếu hiệu số (D-d) càng to có nghĩa là chủng đó có hoạt lực enzymee cao và được tuyển chọn để tiến hành quá trình nghiên cứu.
2.1.1.4. Xác đinh hoạt độ enzymee Protease
Nuôi chủng Aspergillus oryzae trong môi trường Czapek lỏng, lắc trong 48 giờ, lọc dịch enzymee và hút bằng pipet cho vào hộp thạch sữa để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 24 giờ sau đó đo vòng thuỷ phân so với vòng thuỷ phân của dịch enzymee Protease K chuẩn được pha loãng. Xác định được hoạt lực enzymee nghiên cứu ở trong dải nào rồi sẽ tính ra được hoạt độ enzymee nghiên cứu theo phương pháp đường thẳng.
2.1.2. Quy trình sản xuất tương nghiên cứu
Sơ đồ 2.1: Quy trình sản xuất tương nghiên cứu
Đậu tương
Nước đậu (ngâm 7 ngày) Rang chín, loại vỏ Nghiền nhỏ Vo sạch Ủ mốc 3 ngày Tương thành phẩm Lên men Ngả tương Bóp tơi
Chắt lấy nước đậu
Gạo nếp
Ngâm 10 giờ
Đồ chín
Trộn mốc với xôi
Đậu tương đã ngâm
Cấy mốc giống
Thuyết minh quy trình:
+ Ban đầu nguyên liệu đậu tương được vo sạch và để ráo trong vòng 1 giờ mục đích để trong quá trình rang vỏ hạt dễ bị nứt ra và thuận lợi cho việc tách vỏ hạt, sau đó đem đi rang ở niệt độ 180 – 200oC vừa chín và vỏ vẫn còn mầu vàng trắng, tách vỏ và đem nghiền nhỏ vừa phải
+ Tiếp theo, đem hạt nghiền nhỏ ngâm trong nước đun sôi để nguội tránh sự lây nhiễm vi sinh vật trở lại
+ Ngâm nước đậu là quá trình lên men tự nhiên khá phức tạp, nó quyết định mùi vị đặc trưng của tương cổ truyền khi ta ngâm đúng thời gian là 7 ngày và đúng kỹ thuật. Tỷ lệ ngâm nước là 5 – 7 lít nước/ 1 Kg đậu tương.
+ Với gạo nếp ta thường ngâm gạo từ 6 – 10 giờ tuỳ thuộc từng loại gạo nếp sau đó vo gạo và đem đồ xôi (hấp bằng hơi nước). Gạo nếp đồ xôi phải chín đều, không quá nhão hoặc quá khô.
+ Quá trình làm mốc: Mốc giống được sử dụng là mốc Aspergillus oryzae. Mốc giống được trong hộp petry trên môi trường xôi trong thời gian 3 ngày ở nhiệt độ 35 – 45oC. Sau đó lấy mốc giống đã nuôi trộn xôi đã đồ để nguội với tỷ lệ 1% so với xôi đồ, bóp tơi ra trộn đều và nuôi trong 4 ngày.
+ Ngả tương: Tương sau khi ngâm 7 ngày đem chắt nước đã ngâm ra trộn với mốc xôi đã nưôi, bó tơi ra và ủ 1 ngày, sau đó trộn với bã tương và ủ lên men trong thời gian ít nhất là 7 ngày trong chum hoặc thùng đậy kín. Nếu mùa hè thì đem ra phơi nắng, hạn chế sự nhiễm vi sinh vật lạ nhất là vi khuẩn lactic có thể làm cho tương chua hỏng, nếu ở mùa đông thì cần phải kiểm soát nhiệt độ ủ khoảng từ 55 – 60oC. Sau đó chúng ta được tương thành phẩm.
2.2. PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH
2.2.1. Xác định nitơ tổng số bằng phương pháp Kenđan (Kjeldhl) [28]
Xác định Nitơ tổng số bằng phương pháp Kenđan thông thường.
Tiến hành: Cân 0,3 g với bột đậu tương/2g với mẫu tương thành phẩm, trong quá trình vô cơ hóa dung hỗn hợp CuSO4:K2SO4 (1:10). Nhiệt độ đốt mẫu: 210 oC trong 30 phút, sau đó là 310 oC.
Tính kết quả:
Hàm lượng nitơ tổng số tính theo công thức sau:
(a – b) x 1,4 x V x 100 X =
m x V1
Trong đó: X - Hàm lượng nitơ tổng số tính bằng g/l
a - Số ml H2SO4 0,1 N dùng định phân mẫu thí nghiệm b - Số ml H2SO4 0,1 N dùng định phân mẫu kiểm chứng m - Số mg mẫu phân tích đem vô cơ hóa
V- Dung tích bình định mức, ml
V1- Số ml dung dịch hút từ bình định mức cho vào bầu cất 1,4- Số mg nitơ ứng với 1 ml H2SO4 0,1N
2.2.2. Xác định hàm lượng Nitơ Amin bằng phương pháp chuẩn Formol Formol Formol Formol Formol
Đạm Formol tính theo g/kg biểu thị hàm lượng đạm hoà tan dưới dạng axit amin và đạm NH3. [28]