2.1.1.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật
Phân lập chủng vi sinh vật Aspergillus oryzae từ 2 mẫu được lấy từ cở sở sản xuất nước tương (xì dầu) khác nhau là cở sở sản xuất nước tương Bần ở Yên Nhân, Tỉnh Hưng Yên và nước tương Nam Đàn, Tỉnh Nghệ An.
- Dung cụ phân lập Ống nghiệm : 100 ống Hộp Petry : 60 hộp Bình tam giác 1000 ml: 1 bình 500 ml: 2 bình 250 ml: 20 bình Que trang : 5 que
- Thiết bị
Tủ cấy nấm mốc : 2 tủ Nồi hấp thanh trùng : 1 nồi Tủ sấy : 1 tủ Máy đo pH : 1 máy Tủ nuôi : 2 tủ Tủ nuôi lắc : 2 tủ Cân phân tích : 1 cái Kính hiển vi điện tử : 1 cái Micropipet : 2 cái
- Môi trường nuôi cấy nấm mốc có 2 môi trường chính: a. Môi trường thạch sữa
Thạch : 20 g Sữa : 10 g Nước cất : 1000 ml b. Môi trường Czapek
NaNO3 : 3 g KH2PO4 : 1 g
MgSO47H2O : 0,5 g KCl : 0,5 g FeSO4 : 0,01 g Saccharose : 30 g Cao nấm men: 5 g Thạch : 20 g Nước : 1000 ml
Hình 2.1: Mẫu xôi mốc tương Bần, Yên Nhân, Tỉnh Hưng Yên
2.1.1.2. Tiến hành phân lập
Phân lập 2 mẫu mốc xôi lấy từ cơ sở sản xuất tương Bần và Nam Đàn riêng biệt. Lấy mẫu bằng que cấy từ trong ống nghiệp để vào trong bình tam giác 100 ml đã thanh trùng và thêm nước cất vô trùng vào trong bình tam giác, lắc đều, hút bằng micropipet khoảng 90 µl để vào trong ống Amperdox, rồi pha loãng đến 10-5. Sau đó hút dịch 10 µl nuôi trên bề mặt thạch sữa trong hộp petry. Nuôi ở nhiệt 30oC trong tủ nuôi trong thời gian 48 giờ. Quan sát trên bề mặt thạch sữa, chọn những nấm mốc có mầu vàng da cau, lấy cấy Zigzag trên bề mặt thạch sữa 1 lần nữa và tiếp tục làm như vậy cho đến khi thu được chủng thuần khiết và cấy trên bề mặt thạch nghiêng môi trường Czapek và bao quản ở nhiệt độ -20oC. Thường xuyên cấy chuyển sau 3 tháng.
2.1.1.3. Chọn chủng có hoạt lực enzymee protease cao
Từ 40 chủng nấm mốc phân lập từ mẫu mốc xôi tương Bần và 40 chủng từ mốc xôi tương Nam Đàn cấy chấm điểm trên bề mặt thạch hộp. Sau đó đo đường kính vòng thủy phân (D) do enzymee ngoại bào protease thủy phân protein sữa và đo đường kính khuẩn lạcd(d). Nếu hiệu số (D-d) càng to có nghĩa là chủng đó có hoạt lực enzymee cao và được tuyển chọn để tiến hành quá trình nghiên cứu.
2.1.1.4. Xác đinh hoạt độ enzymee Protease
Nuôi chủng Aspergillus oryzae trong môi trường Czapek lỏng, lắc trong 48 giờ, lọc dịch enzymee và hút bằng pipet cho vào hộp thạch sữa để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 24 giờ sau đó đo vòng thuỷ phân so với vòng thuỷ phân của dịch enzymee Protease K chuẩn được pha loãng. Xác định được hoạt lực enzymee nghiên cứu ở trong dải nào rồi sẽ tính ra được hoạt độ enzymee nghiên cứu theo phương pháp đường thẳng.
2.1.2. Quy trình sản xuất tương nghiên cứu
Sơ đồ 2.1: Quy trình sản xuất tương nghiên cứu
Đậu tương
Nước đậu (ngâm 7 ngày) Rang chín, loại vỏ Nghiền nhỏ Vo sạch Ủ mốc 3 ngày Tương thành phẩm Lên men Ngả tương Bóp tơi
Chắt lấy nước đậu
Gạo nếp
Ngâm 10 giờ
Đồ chín
Trộn mốc với xôi
Đậu tương đã ngâm
Cấy mốc giống
Thuyết minh quy trình:
+ Ban đầu nguyên liệu đậu tương được vo sạch và để ráo trong vòng 1 giờ mục đích để trong quá trình rang vỏ hạt dễ bị nứt ra và thuận lợi cho việc tách vỏ hạt, sau đó đem đi rang ở niệt độ 180 – 200oC vừa chín và vỏ vẫn còn mầu vàng trắng, tách vỏ và đem nghiền nhỏ vừa phải
+ Tiếp theo, đem hạt nghiền nhỏ ngâm trong nước đun sôi để nguội tránh sự lây nhiễm vi sinh vật trở lại
+ Ngâm nước đậu là quá trình lên men tự nhiên khá phức tạp, nó quyết định mùi vị đặc trưng của tương cổ truyền khi ta ngâm đúng thời gian là 7 ngày và đúng kỹ thuật. Tỷ lệ ngâm nước là 5 – 7 lít nước/ 1 Kg đậu tương.
+ Với gạo nếp ta thường ngâm gạo từ 6 – 10 giờ tuỳ thuộc từng loại gạo nếp sau đó vo gạo và đem đồ xôi (hấp bằng hơi nước). Gạo nếp đồ xôi phải chín đều, không quá nhão hoặc quá khô.
+ Quá trình làm mốc: Mốc giống được sử dụng là mốc Aspergillus oryzae. Mốc giống được trong hộp petry trên môi trường xôi trong thời gian 3 ngày ở nhiệt độ 35 – 45oC. Sau đó lấy mốc giống đã nuôi trộn xôi đã đồ để nguội với tỷ lệ 1% so với xôi đồ, bóp tơi ra trộn đều và nuôi trong 4 ngày.
+ Ngả tương: Tương sau khi ngâm 7 ngày đem chắt nước đã ngâm ra trộn với mốc xôi đã nưôi, bó tơi ra và ủ 1 ngày, sau đó trộn với bã tương và ủ lên men trong thời gian ít nhất là 7 ngày trong chum hoặc thùng đậy kín. Nếu mùa hè thì đem ra phơi nắng, hạn chế sự nhiễm vi sinh vật lạ nhất là vi khuẩn lactic có thể làm cho tương chua hỏng, nếu ở mùa đông thì cần phải kiểm soát nhiệt độ ủ khoảng từ 55 – 60oC. Sau đó chúng ta được tương thành phẩm.
2.2. PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH
2.2.1. Xác định nitơ tổng số bằng phương pháp Kenđan (Kjeldhl) [28]
Xác định Nitơ tổng số bằng phương pháp Kenđan thông thường.
Tiến hành: Cân 0,3 g với bột đậu tương/2g với mẫu tương thành phẩm, trong quá trình vô cơ hóa dung hỗn hợp CuSO4:K2SO4 (1:10). Nhiệt độ đốt mẫu: 210 oC trong 30 phút, sau đó là 310 oC.
Tính kết quả:
Hàm lượng nitơ tổng số tính theo công thức sau:
(a – b) x 1,4 x V x 100 X =
m x V1
Trong đó: X - Hàm lượng nitơ tổng số tính bằng g/l
a - Số ml H2SO4 0,1 N dùng định phân mẫu thí nghiệm b - Số ml H2SO4 0,1 N dùng định phân mẫu kiểm chứng m - Số mg mẫu phân tích đem vô cơ hóa
V- Dung tích bình định mức, ml
V1- Số ml dung dịch hút từ bình định mức cho vào bầu cất 1,4- Số mg nitơ ứng với 1 ml H2SO4 0,1N
2.2.2. Xác định hàm lượng Nitơ Amin bằng phương pháp chuẩn Formol Formol Formol Formol Formol
Đạm Formol tính theo g/kg biểu thị hàm lượng đạm hoà tan dưới dạng axit amin và đạm NH3. [28]
Tiến hành:
Cân chính xác 10 g tương, pha loãng bằng nước cất và định mức đến 100ml, lắc đều va lọc. Lấy 10 ml dịch lọc cho vào bình tam giác, cho them 10 ml nước chất, thêm 15 giọt chỉ thị hỗn hợp (gồm 15 thể tích dung dịch brothymol xanh 0,04% và 3 thể tích phenolphthalein 0,5%). Nếu dung dịch có màu vàng thì nhỏ vào từng giọt NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch mầu xanh nhạt. Sau đó cho vào 5 ml Formol trung tính, lắc đều và đem chuẩn bằng dung dịch NaOH 0,05N cho đến khi dung dịch chuyển từ màu vàng đến xanh tím.
Cần làm song song 1 mẫu kiểm tra với mẫu phân tích là nước cất và liều lượng các thuốc thử như trên.
Tính toán:
Hàm lượng đạm Formol trong mẫu tương xác định theo công thức sau: (a – b) x 0,0007 x 100 x 1000
X = [g/kg]
10 x 10
Trong đó: a- Số ml NaOH 0,05N đã dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm b- Số ml NaOH 0,05N đã dùng để chuẩn dộ mẫu kiểm tra 0,0007- Số gam đạm tương đương với 1 ml NaOH 0,05N
2.3. KỸ THUẬT KIỂM NGHIỆM AFLATOXIN [8]
Để phát hiện và định lượng Aflatoxin, có ba loại phương pháp: - Phương pháp sinh học
Phương pháp này dựa vào tác dụng sinh học của Aflatoxin trên một số loài sinh vật (vịt con, gà con, chuột nhắt, chuột bạch, phôi gà, chó, khỉ, ấu trùng giáp xác, tế bào nấm, các vi khuẩ Bacillus megaterium, Flavobacterium aurantiacum, v.v.). Thông thường người ta sử dụng vịt con 1 ngày tuổi để phát hiện Aflatoxin vì phương pháp này cho độ nhạy cao (0,1 ppm) và thời gian thí nghiệm (7 – 10 ngày) với các triệu chứng bệnh ở gan rõ rệt.
Tuy nhiên hiện nay phương pháp sinh học ít được dùng vì tốn nhiều thời gian và cần có sự phối hợp của các chuyên gia giải phẫu bệnh học (trường hợp dùng súc vật thí nghiệm).
- Phương pháp hóa lý
Các kỹ thuật sắc ký sau đây đã được sử dụng để phát hiện, định lượng Aflatoxin: Sắc ký cột nhỏ, sắc ký bản mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng cao áp. Kỹ thuật sắc ký bản mỏng là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất vì vừa có độ tin cậy tương đối cao, vừa không cần có trang thiết đắt tiền.
- Phương pháp miễn dịch học
Một số năm gần đấy, mốt số phương pháp miễn dịch học như miễn dịch học phóng xạ (RIA: Radio Immuno Assay), hấp thụ miễn dịch liên kết enzymee (ELISA: Enzymee Linked ImmunoSorbent Assay). Các kỹ thuật này có độ nhạy
cao, phát hiện nhanh và các mẫu thử không cần phải làm sạch kỹ, nhưng kỹ thuật phức tạp, đòi hỏi thao tác chính xác cao, nên chưa được dùng phổ biến.
Bảng 2.1: Một số điểm của các phương pháp kiểm nghiệm Aflatoxin [8]
Phương pháp Khả năng ứng dụng Độ tin cậy Giới hạn phát hiện Giá thiết bị Khả năng tự động hóa
Sinh học Hạn chế Thấp Cao Thấp Không
Sắc ký cột nhỏ Hạn chế Trung
bình Trung bình Thấp Không
Sắc ký bản mỏng Rộng Cao Thấp Thấp Không
Sắc ký lỏng cao áp Rộng Cao Thấp Cao Bộ phận
Sắc ký khí Hạn chế Cao Thấp Cao Bộ phận
ELISA Hạn chế Chưa
biết Thấp Thấp Có
RIA Hạn chế Chưa
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT LỰC THỦY PHÂN CAO
3.1.1. Chủng thuần khiết và có hoạt lực cao
Hình 3.1: Bào tử nang mẫu nghiên cứu soi qua kính hiển vi điện tử
Hình 3.2: Nhánh của nấm mốc nghiên cứu soi qua kinh hiển vi điện tử
Từ 40 chủng nấm sợi phân lập từ mẫu mốc xôi tương Bần và 40 chủng từ mốc xôi tương Nam Đàn chọn lấy 8 chủng có hoạt lực cao (4 chủng từ mẫu Bần và 4 từ mẫu Nam Đàn). Dưới đây là kết của việc đo:
- D: đường kính vòng thủy phân - d : đường kính khuẩn lạc
- D- d: hiệu số so sánh (để biết được hoạt lực enzymee)
Hình 3.3: Vòng thuỷ phân bởi Protease trong môi trường thạch sữa
Bảng 3.1: Các vòng thuỷ phân trong việc tuyển chọn chủng mốc
Mẫu Chủng từ tương Bần Chủng từ tương Nam Đàn
Ngày Φ(mm) AB1 AB2 AB3 AB4 AN1 AN2 AN3 AN4
2 d 21 19,5 18 19 17 18 20 16,5 D 24 22 20 21 19 19,5 18 17,5 D-d 3 2,5 2 2 2 1,5 2,5 1 3 d 29 26 25 26,5 24 27 28 20 D 35 30 28 29,5 26,5 29,5 32,5 22 D-d 6 4 3 3 2,5 2,5 4,5 2 4 d 37 35 32 33 29 31 36 23 D 47 43 38 40,5 34 37 44,5 27,5 D-d 10 8 6 7,5 5 6 8,5 4,5
Nhận xét: Theo bảng trên chủng AB1 của phân lập từ mẫu mốc xôi tương Bần có hoạt lực Protease cao nhất trong các chủng đã phân lập. Trong đó có một số chủng có tốc độ phát triển nhanh ở ngày thứ 2 nhưng lại phát triển chậm lại ở ngày tiếp theo như AN1, chủng AN2 trong thời gian đầu phát triển chậm nhưng ngày thứ 3, thứ 4 lại phát triển nhanh. Đây chứng tỏ rằng từng một có thời gian phát triển không giống nhau và vòng thuỷ phân cũng khác nhau. Vì vậy trong quá trình nghiên cứu thì chúng ta chọn lấy chủng nào có vòng thủy phân cao nhất để tiến hành sản xuất xì dầu bởi nó là chủng tiết ra enzyme Protease nhiều chất để thuỷ phân hàm lượng protein có trong đậu tương với thời gian ngắn nhất và hiệu quả thuỷ phân tốt nhất.
3.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp Protease sinh tổng hợp Protease sinh tổng hợp Protease sinh tổng hợp Protease sinh tổng hợp Protease
Nuôi nấm mốc thuần khiết trong môi trường Czapek lỏng trong tủ nuôi lắc trong thời gian 48 giờ và sau lấy dịch chiết enzymee nhỏ vào lỗ thạch sữa trong thời gian 24 giờ, đo đường kính vòng thủy phân.
Hình 3.4: Pellet chủng AB1 nuôi trong bình tam giác với môi trường Czapek
Tiến hành thử hoạt lực của các yếu tố ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp Protease bằng cách đục lỗ thạch sữa trên khay thủy tinh với đường kính của lỗ đục (d = 10 mm) và đường vòng thủy phân (D) xung quanh lỗ đục.
Nhận xét: Trong cùng một khay thuỷ tinh thì lượng thạch sữa được phân bố
đồng đều, lượng dịch enzyme được từ nuôi nấm mốc Aspergillus oryzae đưa vào lỗ đục với đường kính bằng nhau nếu lỗ thạch sữa nào có vòng thuỷ phân to nhất là chủng nấm mốc đã nuôi lấy dịch đó là chủng có hoạt lực mạnh nhất.
3.1.2.1. Nguồn Carbon
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của loại nguồn carbon
Đường kính D (mm)
Saccharose Glucose Lactose Xylose
Mẻ 1 21 16 17,5 12 Mẻ 2 20 15,5 17 11 Mẻ 3 20,5 16 16,5 12,5 Mẻ 4 22 14,5 17 13 Trung bình 20,9 15,5 17 12,1 Nhận xét:
Saccharose, Glucose, Lactose, Xylose. Các đường trên được bổ sung vào môi trường lên men bằng thay thế luân phiên trong các 4 loại đường trên. Các loại đường này là loại đường thông dụng và có giá thành từ rẻ đến đắt và rất đắt, ví dụ đường Saccharose và Glucose là tương đối rẻ, đường Lactose đắt hơn đường Saccharose và Glucose, và đường Xylose là đắt nhất trong các loại đường dùng trong quá trình nghiên cứu. Nếu chủng nấm mốc thích hợp với loại đường có giá thành cao thì cần xem xét về hiệu quả kinh tế bằng cách so sánh giá thành với hiệu quả thuỷ phân protein của chủng nấm mốc đó. Ví dụ trong sơ đồ trên, chủng nấm mốc nghiên cứu thích hợp với đường Lactose hơn đường Glucơse với vòng thủy phân trung 17mm so với 15,5mm là 17/15,5 = 1,1 coi như không đáng kể nhưng giá thành của đường Lactose lại cao hơn nhiều lần so với giá thành của đường Glucose, trong trường hợp này dựa trên hiệu quả sản xuất kinh doanh thì phải chọn dùng đường Glucose. Dựa trên quan điểm này trong nghiên cứu của đề tài thì em chọn đường Saccharose vừa thoả mãn được ưu thế về mặt khoa học lẫn hiệu quả kinh tế.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ nguồn Carbon
Lượng Saccharose (g) 0 10 30 50 70 90 Mẻ 1 13 15 20 26 24 20,5 Mẻ 2 12 14 19 27 25,5 21 Mẻ 3 13 15 20 28 26 22 Mẻ 4 12,5 14,5 20,5 27 25 21 Trung bình 12,6 14,6 19,9 27 25,1 21,1
Nhận xét:
Sau khi chọn được loại đường thích hợp cho quá trình sinh trưởng của nấm men thì cần phải chọn nồng độ đường tối ưu cho quá trình nuôi cấy để thu được enzyme Protease có hoạt lực cao nhất. Theo sơ đồ trên thì nồng độ đường được chọn là 50g đường Saccharose trong môi trường Czapek 1 000 ml.
3.1.2.2. Nguồn Nitơ
Nguồn dinh dưỡng có chứa Nitơ như sau:
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nguồn Nitơ
Đường
kính D 0 NaNO3 (NH4)2SO4 NH4NO3 Cao thịt Peptone
Tri- Amoni Citrat Mẻ 1 11 17 20 15 18 17 14 Mẻ 2 12 17,5 22 14 19 18 13 Mẻ 3 11 17 21 16 18,5 19 14 Mẻ 4 12 16 23 15 20 18,5 14,5 TB 11,5 16,9 21,5 15 18,5 18,1 13,9
Nhận xét: Nguồn Nitơ sử dụng để tìm ra nguồn Nitơ tối ưu, chúng ta cả nguồn
Nitơ vô cơ như NaNO3, (NH4)2SO4, NH4SO4, Tri-Amoni Citrat và nguồn Nitơ hữu cơ như Cao thịt, Peptone. Theo kết quả trên (NH4)2SO4 là tối ưu nhất và cũng đúng theo giá trị kinh tế.
3.1.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ nguồn Nitơ
Thí nghiệm được tiến hành nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml với lượng môi trường lỏng 100 ml vì vậy số lượng dưới đây được tính theo lít (100ml x 10):
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ nguồn Nitơ
(NH4)2SO4(g) 0 1 3 5 7 Mẻ 1 11 17 20 19 15 Mẻ 2 12 16 22 18 16 Mẻ 3 11 16 21 17 14 Mẻ 4 12 17 23 19 15 Trung Bình 11,5 16,5 21,5 18,3 15