Formol
Đạm Formol tính theo g/kg biểu thị hàm lượng đạm hoà tan dưới dạng axit amin và đạm NH3. [28]
Tiến hành:
Cân chính xác 10 g tương, pha loãng bằng nước cất và định mức đến 100ml, lắc đều va lọc. Lấy 10 ml dịch lọc cho vào bình tam giác, cho them 10 ml nước chất, thêm 15 giọt chỉ thị hỗn hợp (gồm 15 thể tích dung dịch brothymol xanh 0,04% và 3 thể tích phenolphthalein 0,5%). Nếu dung dịch có màu vàng thì nhỏ vào từng giọt NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch mầu xanh nhạt. Sau đó cho vào 5 ml Formol trung tính, lắc đều và đem chuẩn bằng dung dịch NaOH 0,05N cho đến khi dung dịch chuyển từ màu vàng đến xanh tím.
Cần làm song song 1 mẫu kiểm tra với mẫu phân tích là nước cất và liều lượng các thuốc thử như trên.
Tính toán:
Hàm lượng đạm Formol trong mẫu tương xác định theo công thức sau: (a – b) x 0,0007 x 100 x 1000
X = [g/kg]
10 x 10
Trong đó: a- Số ml NaOH 0,05N đã dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm b- Số ml NaOH 0,05N đã dùng để chuẩn dộ mẫu kiểm tra 0,0007- Số gam đạm tương đương với 1 ml NaOH 0,05N
2.3. KỸ THUẬT KIỂM NGHIỆM AFLATOXIN [8]
Để phát hiện và định lượng Aflatoxin, có ba loại phương pháp: - Phương pháp sinh học
Phương pháp này dựa vào tác dụng sinh học của Aflatoxin trên một số loài sinh vật (vịt con, gà con, chuột nhắt, chuột bạch, phôi gà, chó, khỉ, ấu trùng giáp xác, tế bào nấm, các vi khuẩ Bacillus megaterium, Flavobacterium aurantiacum, v.v.). Thông thường người ta sử dụng vịt con 1 ngày tuổi để phát hiện Aflatoxin vì phương pháp này cho độ nhạy cao (0,1 ppm) và thời gian thí nghiệm (7 – 10 ngày) với các triệu chứng bệnh ở gan rõ rệt.
Tuy nhiên hiện nay phương pháp sinh học ít được dùng vì tốn nhiều thời gian và cần có sự phối hợp của các chuyên gia giải phẫu bệnh học (trường hợp dùng súc vật thí nghiệm).
- Phương pháp hóa lý
Các kỹ thuật sắc ký sau đây đã được sử dụng để phát hiện, định lượng Aflatoxin: Sắc ký cột nhỏ, sắc ký bản mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng cao áp. Kỹ thuật sắc ký bản mỏng là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất vì vừa có độ tin cậy tương đối cao, vừa không cần có trang thiết đắt tiền.
- Phương pháp miễn dịch học
Một số năm gần đấy, mốt số phương pháp miễn dịch học như miễn dịch học phóng xạ (RIA: Radio Immuno Assay), hấp thụ miễn dịch liên kết enzymee (ELISA: Enzymee Linked ImmunoSorbent Assay). Các kỹ thuật này có độ nhạy
cao, phát hiện nhanh và các mẫu thử không cần phải làm sạch kỹ, nhưng kỹ thuật phức tạp, đòi hỏi thao tác chính xác cao, nên chưa được dùng phổ biến.
Bảng 2.1: Một số điểm của các phương pháp kiểm nghiệm Aflatoxin [8]
Phương pháp Khả năng ứng dụng Độ tin cậy Giới hạn phát hiện Giá thiết bị Khả năng tự động hóa
Sinh học Hạn chế Thấp Cao Thấp Không
Sắc ký cột nhỏ Hạn chế Trung
bình Trung bình Thấp Không
Sắc ký bản mỏng Rộng Cao Thấp Thấp Không
Sắc ký lỏng cao áp Rộng Cao Thấp Cao Bộ phận
Sắc ký khí Hạn chế Cao Thấp Cao Bộ phận
ELISA Hạn chế Chưa
biết Thấp Thấp Có
RIA Hạn chế Chưa
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT LỰC THỦY PHÂN CAO
3.1.1. Chủng thuần khiết và có hoạt lực cao
Hình 3.1: Bào tử nang mẫu nghiên cứu soi qua kính hiển vi điện tử
Hình 3.2: Nhánh của nấm mốc nghiên cứu soi qua kinh hiển vi điện tử
Từ 40 chủng nấm sợi phân lập từ mẫu mốc xôi tương Bần và 40 chủng từ mốc xôi tương Nam Đàn chọn lấy 8 chủng có hoạt lực cao (4 chủng từ mẫu Bần và 4 từ mẫu Nam Đàn). Dưới đây là kết của việc đo:
- D: đường kính vòng thủy phân - d : đường kính khuẩn lạc
- D- d: hiệu số so sánh (để biết được hoạt lực enzymee)
Hình 3.3: Vòng thuỷ phân bởi Protease trong môi trường thạch sữa
Bảng 3.1: Các vòng thuỷ phân trong việc tuyển chọn chủng mốc
Mẫu Chủng từ tương Bần Chủng từ tương Nam Đàn
Ngày Φ(mm) AB1 AB2 AB3 AB4 AN1 AN2 AN3 AN4
2 d 21 19,5 18 19 17 18 20 16,5 D 24 22 20 21 19 19,5 18 17,5 D-d 3 2,5 2 2 2 1,5 2,5 1 3 d 29 26 25 26,5 24 27 28 20 D 35 30 28 29,5 26,5 29,5 32,5 22 D-d 6 4 3 3 2,5 2,5 4,5 2 4 d 37 35 32 33 29 31 36 23 D 47 43 38 40,5 34 37 44,5 27,5 D-d 10 8 6 7,5 5 6 8,5 4,5
Nhận xét: Theo bảng trên chủng AB1 của phân lập từ mẫu mốc xôi tương Bần có hoạt lực Protease cao nhất trong các chủng đã phân lập. Trong đó có một số chủng có tốc độ phát triển nhanh ở ngày thứ 2 nhưng lại phát triển chậm lại ở ngày tiếp theo như AN1, chủng AN2 trong thời gian đầu phát triển chậm nhưng ngày thứ 3, thứ 4 lại phát triển nhanh. Đây chứng tỏ rằng từng một có thời gian phát triển không giống nhau và vòng thuỷ phân cũng khác nhau. Vì vậy trong quá trình nghiên cứu thì chúng ta chọn lấy chủng nào có vòng thủy phân cao nhất để tiến hành sản xuất xì dầu bởi nó là chủng tiết ra enzyme Protease nhiều chất để thuỷ phân hàm lượng protein có trong đậu tương với thời gian ngắn nhất và hiệu quả thuỷ phân tốt nhất.
3.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp Protease sinh tổng hợp Protease sinh tổng hợp Protease sinh tổng hợp Protease sinh tổng hợp Protease
Nuôi nấm mốc thuần khiết trong môi trường Czapek lỏng trong tủ nuôi lắc trong thời gian 48 giờ và sau lấy dịch chiết enzymee nhỏ vào lỗ thạch sữa trong thời gian 24 giờ, đo đường kính vòng thủy phân.
Hình 3.4: Pellet chủng AB1 nuôi trong bình tam giác với môi trường Czapek
Tiến hành thử hoạt lực của các yếu tố ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp Protease bằng cách đục lỗ thạch sữa trên khay thủy tinh với đường kính của lỗ đục (d = 10 mm) và đường vòng thủy phân (D) xung quanh lỗ đục.
Nhận xét: Trong cùng một khay thuỷ tinh thì lượng thạch sữa được phân bố
đồng đều, lượng dịch enzyme được từ nuôi nấm mốc Aspergillus oryzae đưa vào lỗ đục với đường kính bằng nhau nếu lỗ thạch sữa nào có vòng thuỷ phân to nhất là chủng nấm mốc đã nuôi lấy dịch đó là chủng có hoạt lực mạnh nhất.
3.1.2.1. Nguồn Carbon
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của loại nguồn carbon
Đường kính D (mm)
Saccharose Glucose Lactose Xylose
Mẻ 1 21 16 17,5 12 Mẻ 2 20 15,5 17 11 Mẻ 3 20,5 16 16,5 12,5 Mẻ 4 22 14,5 17 13 Trung bình 20,9 15,5 17 12,1 Nhận xét:
Saccharose, Glucose, Lactose, Xylose. Các đường trên được bổ sung vào môi trường lên men bằng thay thế luân phiên trong các 4 loại đường trên. Các loại đường này là loại đường thông dụng và có giá thành từ rẻ đến đắt và rất đắt, ví dụ đường Saccharose và Glucose là tương đối rẻ, đường Lactose đắt hơn đường Saccharose và Glucose, và đường Xylose là đắt nhất trong các loại đường dùng trong quá trình nghiên cứu. Nếu chủng nấm mốc thích hợp với loại đường có giá thành cao thì cần xem xét về hiệu quả kinh tế bằng cách so sánh giá thành với hiệu quả thuỷ phân protein của chủng nấm mốc đó. Ví dụ trong sơ đồ trên, chủng nấm mốc nghiên cứu thích hợp với đường Lactose hơn đường Glucơse với vòng thủy phân trung 17mm so với 15,5mm là 17/15,5 = 1,1 coi như không đáng kể nhưng giá thành của đường Lactose lại cao hơn nhiều lần so với giá thành của đường Glucose, trong trường hợp này dựa trên hiệu quả sản xuất kinh doanh thì phải chọn dùng đường Glucose. Dựa trên quan điểm này trong nghiên cứu của đề tài thì em chọn đường Saccharose vừa thoả mãn được ưu thế về mặt khoa học lẫn hiệu quả kinh tế.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ nguồn Carbon
Lượng Saccharose (g) 0 10 30 50 70 90 Mẻ 1 13 15 20 26 24 20,5 Mẻ 2 12 14 19 27 25,5 21 Mẻ 3 13 15 20 28 26 22 Mẻ 4 12,5 14,5 20,5 27 25 21 Trung bình 12,6 14,6 19,9 27 25,1 21,1
Nhận xét:
Sau khi chọn được loại đường thích hợp cho quá trình sinh trưởng của nấm men thì cần phải chọn nồng độ đường tối ưu cho quá trình nuôi cấy để thu được enzyme Protease có hoạt lực cao nhất. Theo sơ đồ trên thì nồng độ đường được chọn là 50g đường Saccharose trong môi trường Czapek 1 000 ml.
3.1.2.2. Nguồn Nitơ
Nguồn dinh dưỡng có chứa Nitơ như sau:
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nguồn Nitơ
Đường
kính D 0 NaNO3 (NH4)2SO4 NH4NO3 Cao thịt Peptone
Tri- Amoni Citrat Mẻ 1 11 17 20 15 18 17 14 Mẻ 2 12 17,5 22 14 19 18 13 Mẻ 3 11 17 21 16 18,5 19 14 Mẻ 4 12 16 23 15 20 18,5 14,5 TB 11,5 16,9 21,5 15 18,5 18,1 13,9
Nhận xét: Nguồn Nitơ sử dụng để tìm ra nguồn Nitơ tối ưu, chúng ta cả nguồn
Nitơ vô cơ như NaNO3, (NH4)2SO4, NH4SO4, Tri-Amoni Citrat và nguồn Nitơ hữu cơ như Cao thịt, Peptone. Theo kết quả trên (NH4)2SO4 là tối ưu nhất và cũng đúng theo giá trị kinh tế.
3.1.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ nguồn Nitơ
Thí nghiệm được tiến hành nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml với lượng môi trường lỏng 100 ml vì vậy số lượng dưới đây được tính theo lít (100ml x 10):
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ nguồn Nitơ
(NH4)2SO4(g) 0 1 3 5 7 Mẻ 1 11 17 20 19 15 Mẻ 2 12 16 22 18 16 Mẻ 3 11 16 21 17 14 Mẻ 4 12 17 23 19 15 Trung Bình 11,5 16,5 21,5 18,3 15
3.1.2.4. Ảnh hưởng của pH
Protease là enzymee kiềm vì điều kiện nuôi cấy trong môi trường kiềm cao
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của pH pH 7 8 9 10 Mẻ 1 14 15,5 18,5 16 Mẻ 2 13,5 15 19 15 Mẻ 3 13 16 18 17 Mẻ 4 14 15 19 16 TB 13,6 15,4 18,6 16
3.1.2.3.Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ của Aspergillus oryzae năm trong khoảng nhiệt độ từ 30 đến 60oC
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tiết enzymee
Nhiệt độ (oC) 30 40 50 60 Mẻ 1 21,5 24 30 22 Mẻ 2 20 25 31 21 Mẻ 3 19 24 30 22 Mẻ 4 19,5 23,5 30 22,5 Trung Bình 20 24,1 30,3 21,9
Nhận xét: Nhiệt độ là một yếu quan trọng trong điều kiện sinh trưởng của nấm
mốc. Từng chủng một sẽ có một nhiệt độ tối ưu riêng, bình thường nhiệt độ tối ưu sẽ nằm trong khoảng 30 – 60 oC. Vì trong thí nghiệm cho thấy nhiệt độ tối ưu là 50oC.
3.2. Đo hoạt lực enzymee Protease
Môi trường Czapek tối ưu cho chủng Aspergillus oryzae nghiên cứu là: - (NH4 )2SO4 :3g - KH2PO4 :1g - MgSO4 7H2O :0,5g - KCl :0,5g pH = 9; Nhiệt độ 50oC - FeSO4 :0,01g - Saccharose :30g - Cao nấm men :5g - Nước cất : 1000 ml
Sau khi nuôi trong môi trường tối ưu trên trong bình tam giác ở trạng thái lỏng trong thời gian 2 ngày sau đó hút dịch enzyme cho vào lỗ đục thạch sữa (thạch: 20g, Sữa gầy: 10g định mức đến 1000 ml bằng nước cất) và cùng với enzyme chuẩn là Protease K với hoạt lực 10 IU và 20 IU, đặt ở nhiệt độ phòng.
Hình 3.6: A1 là vòng thuỷ phân của Protease K chuẩn 10 IU B1 là vòng thuỷ phân của mẫu nghiên cứu
Hình 3.7: A2 là vòng thuỷ phân của Protease K chuẩn 20 IU B2 là vòng thuỷ phân của mẫu nghiên cứu
A1
B1
B2
Theo sơ đồ trên chúng ta tìm được nồng độ mẫu nghiên cứu là 16 IU.
3.3. Ứng dụng nấm mốc đã tuyển chọn vào sản xuất xì dầu 3.3.1. Làm mốc tương
Hình 3.8: Chủng mốc AB1 nuôi trên môi trường xôi ở nhiệt độ 40oC trong thời gian 3 ngày
Hình 3.9: Nhân mốc trên xôi để tiến hành lên men, mẫu nuôi trong thời gian 3 ngày ở nhiệt độ phòng
Chủng nấm mốc sau khi nuôi trong hộp petry trên môi trường xôi trong thời gian từ 2 – 3 ngày sau đó nhân lên với xôi đồ bằng tỷ 1%, để nuôi ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày, trong khi nuôi để hạn sự lây nhiễm vi sinh vật lạ và giữ độ ẩm tốt thì cần phủ một lớp vải Caosu để mốc phát triển nhanh, nhưng phải lấy bỏ hơi nước đọng trên Caosu một cách nhẹ nhàng để không cho giọt nước rơi xuống mốc xôi dẫn đến chua tương sau này.
3.3.2. Ngả tương
Đậu tương sau khi rang chín, bỏ vỏ và nghiên nhỏ được ngâm trong thời gian 7 ngày. Chắt lấy nước ngâm đậu trộn với mốc xôi, bóp tơi ra và trộn với tương bã lại. Trong tương 5 lít có tỷ lệ như sau: Đậu tương: Mốc xôi: Muối là 1 : 0,5 : 1. Tương được ủ lên men ít nhất là 7 ngày trở lên.
Hình 3.10: Tương lên men 15 ngày
3.3.3. Kết quả phân tích mẫu tương a. Phân tích chỉ tiêu cơ bản của nước tươnga. Phân tích chỉ tiêu cơ bản của nước tươnga. Phân tích chỉ tiêu cơ bản của nước tươnga. Phân tích chỉ tiêu cơ bản của nước tương a. Phân tích chỉ tiêu cơ bản của nước tương
Sau khi lên men được 15 ngày, chúng tôi tiến hành phân tích và thu được kết quả như sau:
Bảng 3.8. Kết quả phân tích mẫu tương lên men 15 ngày
TT Chỉ tiêu Đơn vị Kết quả
1 Hàm lượng Protein g/l 91
2 Hàm lượng Nitơ Formol g/l 4,4
3 Hàm lượng Nitơ axit amin g/l 0,15
4 Hàm lượng Axit Axetic g/l 4,61
Nhận xét: Theo kết quả trên chúng ta thấy rằng hàm lượng Nitơ axit amin còn thấp
do thời gian lên men còn ngắn, vậy chúng ta cần thêm thời gian để lên men triệt để.
b. Phân tích độc tố Aflatoxin
Kết quả kiểm tra sự có mặt của độc tố Aflatoxin trong mẫu tương lên men 15 ngày cho kết quả âm tính có nghĩa là chủng nấm mốc mà chúng ta đã phân lập và tuyển chọn là chủng thuần khiết và quá trình lên men cũng đảm bảo sự được sự nhiễm tạp cần thiết.
KẾT LUẬN và KIẾN NGHỊ I. KẾT LUẬN
Sau thời gian nghiên cứu ở phòng thí nghiệm về quy trình sản xuất xì dầu an toàn về độc tố 3-MCPD và Aflatoxin, chúng tôi rút ra được một số kết luận như sau:
1. Phân lập và tuyển chọn được chủng AB1 thuần khiết từ mẫu mốc xôi của tương Bần và tương Nam Đàn có hoạt lực thuỷ phân Protease cao là 16 IU. Bần và tương Nam Đàn có hoạt lực thuỷ phân Protease cao là 16 IU.
2. Tìm được các điều kiện tối ưu cho chủng AB1 trong đó nguồn Carbon thích hợp là Saccharose với lượng 50g/l môi trương nuôi cấy, nguồn nitơ thích hợp là là Saccharose với lượng 50g/l môi trương nuôi cấy, nguồn nitơ thích hợp là (NH4)2SO4 với lượng tối thích là 3g/l môi trường nuôi cấy, pH = 9 và nhiệt độ là 50oC.
3. Áp dụng kết quả nghiên cứu vào trong quá trình sản xuất nước tương truyền thống chúng ta thấy rằng thời gian ủ mốc xôi để sản xuất nhanh hơn chỉ trong vòng thống chúng ta thấy rằng thời gian ủ mốc xôi để sản xuất nhanh hơn chỉ trong vòng 3 ngày so với sản xuất truyền thống là 7 ngày, chủng thuần khiết an toàn đảm bảo không có Aflatoxin, quy trình sản xuất không tạo 3-MCPD
4. Sau quá trình lên men sản xuất được 15 ngày tính từ khi ngả tương ta thu được kết quả như sau: kết quả như sau:
- Hàm lượng Protein tổng số là 91 g/l - Hàm lượng Nitơ Formol là 4,4 g/l - Hàm lượng Nitơ Formol là 4,4 g/l - Hàm lượng Nitơ axit amin là 0,15 g/l - Hàm lượng Axit axetic là 4,61 g/l
II. KIẾN NGHỊ
Do thời gian trong quá trình lên men chỉ 15 ngày thì hàm lượng Nitơ axit amin thuỷ phân còn ít, vì vậy nếu muốn thuỷ phân triệt để hơn chúng ta cần lên men