sinh tổng hợp Protease
Nuôi nấm mốc thuần khiết trong môi trường Czapek lỏng trong tủ nuôi lắc trong thời gian 48 giờ và sau lấy dịch chiết enzymee nhỏ vào lỗ thạch sữa trong thời gian 24 giờ, đo đường kính vòng thủy phân.
Hình 3.4: Pellet chủng AB1 nuôi trong bình tam giác với môi trường Czapek
Tiến hành thử hoạt lực của các yếu tố ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp Protease bằng cách đục lỗ thạch sữa trên khay thủy tinh với đường kính của lỗ đục (d = 10 mm) và đường vòng thủy phân (D) xung quanh lỗ đục.
Nhận xét: Trong cùng một khay thuỷ tinh thì lượng thạch sữa được phân bố
đồng đều, lượng dịch enzyme được từ nuôi nấm mốc Aspergillus oryzae đưa vào lỗ đục với đường kính bằng nhau nếu lỗ thạch sữa nào có vòng thuỷ phân to nhất là chủng nấm mốc đã nuôi lấy dịch đó là chủng có hoạt lực mạnh nhất.
3.1.2.1. Nguồn Carbon
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của loại nguồn carbon
Đường kính D (mm)
Saccharose Glucose Lactose Xylose
Mẻ 1 21 16 17,5 12 Mẻ 2 20 15,5 17 11 Mẻ 3 20,5 16 16,5 12,5 Mẻ 4 22 14,5 17 13 Trung bình 20,9 15,5 17 12,1 Nhận xét:
Saccharose, Glucose, Lactose, Xylose. Các đường trên được bổ sung vào môi trường lên men bằng thay thế luân phiên trong các 4 loại đường trên. Các loại đường này là loại đường thông dụng và có giá thành từ rẻ đến đắt và rất đắt, ví dụ đường Saccharose và Glucose là tương đối rẻ, đường Lactose đắt hơn đường Saccharose và Glucose, và đường Xylose là đắt nhất trong các loại đường dùng trong quá trình nghiên cứu. Nếu chủng nấm mốc thích hợp với loại đường có giá thành cao thì cần xem xét về hiệu quả kinh tế bằng cách so sánh giá thành với hiệu quả thuỷ phân protein của chủng nấm mốc đó. Ví dụ trong sơ đồ trên, chủng nấm mốc nghiên cứu thích hợp với đường Lactose hơn đường Glucơse với vòng thủy phân trung 17mm so với 15,5mm là 17/15,5 = 1,1 coi như không đáng kể nhưng giá thành của đường Lactose lại cao hơn nhiều lần so với giá thành của đường Glucose, trong trường hợp này dựa trên hiệu quả sản xuất kinh doanh thì phải chọn dùng đường Glucose. Dựa trên quan điểm này trong nghiên cứu của đề tài thì em chọn đường Saccharose vừa thoả mãn được ưu thế về mặt khoa học lẫn hiệu quả kinh tế.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ nguồn Carbon
Lượng Saccharose (g) 0 10 30 50 70 90 Mẻ 1 13 15 20 26 24 20,5 Mẻ 2 12 14 19 27 25,5 21 Mẻ 3 13 15 20 28 26 22 Mẻ 4 12,5 14,5 20,5 27 25 21 Trung bình 12,6 14,6 19,9 27 25,1 21,1
Nhận xét:
Sau khi chọn được loại đường thích hợp cho quá trình sinh trưởng của nấm men thì cần phải chọn nồng độ đường tối ưu cho quá trình nuôi cấy để thu được enzyme Protease có hoạt lực cao nhất. Theo sơ đồ trên thì nồng độ đường được chọn là 50g đường Saccharose trong môi trường Czapek 1 000 ml.
3.1.2.2. Nguồn Nitơ
Nguồn dinh dưỡng có chứa Nitơ như sau:
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nguồn Nitơ
Đường
kính D 0 NaNO3 (NH4)2SO4 NH4NO3 Cao thịt Peptone
Tri- Amoni Citrat Mẻ 1 11 17 20 15 18 17 14 Mẻ 2 12 17,5 22 14 19 18 13 Mẻ 3 11 17 21 16 18,5 19 14 Mẻ 4 12 16 23 15 20 18,5 14,5 TB 11,5 16,9 21,5 15 18,5 18,1 13,9
Nhận xét: Nguồn Nitơ sử dụng để tìm ra nguồn Nitơ tối ưu, chúng ta cả nguồn
Nitơ vô cơ như NaNO3, (NH4)2SO4, NH4SO4, Tri-Amoni Citrat và nguồn Nitơ hữu cơ như Cao thịt, Peptone. Theo kết quả trên (NH4)2SO4 là tối ưu nhất và cũng đúng theo giá trị kinh tế.
3.1.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ nguồn Nitơ
Thí nghiệm được tiến hành nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml với lượng môi trường lỏng 100 ml vì vậy số lượng dưới đây được tính theo lít (100ml x 10):
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ nguồn Nitơ
(NH4)2SO4(g) 0 1 3 5 7 Mẻ 1 11 17 20 19 15 Mẻ 2 12 16 22 18 16 Mẻ 3 11 16 21 17 14 Mẻ 4 12 17 23 19 15 Trung Bình 11,5 16,5 21,5 18,3 15
3.1.2.4. Ảnh hưởng của pH
Protease là enzymee kiềm vì điều kiện nuôi cấy trong môi trường kiềm cao
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của pH pH 7 8 9 10 Mẻ 1 14 15,5 18,5 16 Mẻ 2 13,5 15 19 15 Mẻ 3 13 16 18 17 Mẻ 4 14 15 19 16 TB 13,6 15,4 18,6 16
3.1.2.3.Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ của Aspergillus oryzae năm trong khoảng nhiệt độ từ 30 đến 60oC
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tiết enzymee
Nhiệt độ (oC) 30 40 50 60 Mẻ 1 21,5 24 30 22 Mẻ 2 20 25 31 21 Mẻ 3 19 24 30 22 Mẻ 4 19,5 23,5 30 22,5 Trung Bình 20 24,1 30,3 21,9
Nhận xét: Nhiệt độ là một yếu quan trọng trong điều kiện sinh trưởng của nấm
mốc. Từng chủng một sẽ có một nhiệt độ tối ưu riêng, bình thường nhiệt độ tối ưu sẽ nằm trong khoảng 30 – 60 oC. Vì trong thí nghiệm cho thấy nhiệt độ tối ưu là 50oC.
3.2. Đo hoạt lực enzymee Protease
Môi trường Czapek tối ưu cho chủng Aspergillus oryzae nghiên cứu là: - (NH4 )2SO4 :3g - KH2PO4 :1g - MgSO4 7H2O :0,5g - KCl :0,5g pH = 9; Nhiệt độ 50oC - FeSO4 :0,01g - Saccharose :30g - Cao nấm men :5g - Nước cất : 1000 ml
Sau khi nuôi trong môi trường tối ưu trên trong bình tam giác ở trạng thái lỏng trong thời gian 2 ngày sau đó hút dịch enzyme cho vào lỗ đục thạch sữa (thạch: 20g, Sữa gầy: 10g định mức đến 1000 ml bằng nước cất) và cùng với enzyme chuẩn là Protease K với hoạt lực 10 IU và 20 IU, đặt ở nhiệt độ phòng.
Hình 3.6: A1 là vòng thuỷ phân của Protease K chuẩn 10 IU B1 là vòng thuỷ phân của mẫu nghiên cứu
Hình 3.7: A2 là vòng thuỷ phân của Protease K chuẩn 20 IU B2 là vòng thuỷ phân của mẫu nghiên cứu
A1
B1
B2
Theo sơ đồ trên chúng ta tìm được nồng độ mẫu nghiên cứu là 16 IU.
3.3. Ứng dụng nấm mốc đã tuyển chọn vào sản xuất xì dầu 3.3.1. Làm mốc tương
Hình 3.8: Chủng mốc AB1 nuôi trên môi trường xôi ở nhiệt độ 40oC trong thời gian 3 ngày
Hình 3.9: Nhân mốc trên xôi để tiến hành lên men, mẫu nuôi trong thời gian 3 ngày ở nhiệt độ phòng
Chủng nấm mốc sau khi nuôi trong hộp petry trên môi trường xôi trong thời gian từ 2 – 3 ngày sau đó nhân lên với xôi đồ bằng tỷ 1%, để nuôi ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày, trong khi nuôi để hạn sự lây nhiễm vi sinh vật lạ và giữ độ ẩm tốt thì cần phủ một lớp vải Caosu để mốc phát triển nhanh, nhưng phải lấy bỏ hơi nước đọng trên Caosu một cách nhẹ nhàng để không cho giọt nước rơi xuống mốc xôi dẫn đến chua tương sau này.
3.3.2. Ngả tương
Đậu tương sau khi rang chín, bỏ vỏ và nghiên nhỏ được ngâm trong thời gian 7 ngày. Chắt lấy nước ngâm đậu trộn với mốc xôi, bóp tơi ra và trộn với tương bã lại. Trong tương 5 lít có tỷ lệ như sau: Đậu tương: Mốc xôi: Muối là 1 : 0,5 : 1. Tương được ủ lên men ít nhất là 7 ngày trở lên.
Hình 3.10: Tương lên men 15 ngày
3.3.3. Kết quả phân tích mẫu tương a. Phân tích chỉ tiêu cơ bản của nước tươnga. Phân tích chỉ tiêu cơ bản của nước tươnga. Phân tích chỉ tiêu cơ bản của nước tươnga. Phân tích chỉ tiêu cơ bản của nước tương a. Phân tích chỉ tiêu cơ bản của nước tương
Sau khi lên men được 15 ngày, chúng tôi tiến hành phân tích và thu được kết quả như sau:
Bảng 3.8. Kết quả phân tích mẫu tương lên men 15 ngày
TT Chỉ tiêu Đơn vị Kết quả
1 Hàm lượng Protein g/l 91
2 Hàm lượng Nitơ Formol g/l 4,4
3 Hàm lượng Nitơ axit amin g/l 0,15
4 Hàm lượng Axit Axetic g/l 4,61
Nhận xét: Theo kết quả trên chúng ta thấy rằng hàm lượng Nitơ axit amin còn thấp
do thời gian lên men còn ngắn, vậy chúng ta cần thêm thời gian để lên men triệt để.
b. Phân tích độc tố Aflatoxin
Kết quả kiểm tra sự có mặt của độc tố Aflatoxin trong mẫu tương lên men 15 ngày cho kết quả âm tính có nghĩa là chủng nấm mốc mà chúng ta đã phân lập và tuyển chọn là chủng thuần khiết và quá trình lên men cũng đảm bảo sự được sự nhiễm tạp cần thiết.
KẾT LUẬN và KIẾN NGHỊ I. KẾT LUẬN
Sau thời gian nghiên cứu ở phòng thí nghiệm về quy trình sản xuất xì dầu an toàn về độc tố 3-MCPD và Aflatoxin, chúng tôi rút ra được một số kết luận như sau:
1. Phân lập và tuyển chọn được chủng AB1 thuần khiết từ mẫu mốc xôi của tương Bần và tương Nam Đàn có hoạt lực thuỷ phân Protease cao là 16 IU. Bần và tương Nam Đàn có hoạt lực thuỷ phân Protease cao là 16 IU.
2. Tìm được các điều kiện tối ưu cho chủng AB1 trong đó nguồn Carbon thích hợp là Saccharose với lượng 50g/l môi trương nuôi cấy, nguồn nitơ thích hợp là là Saccharose với lượng 50g/l môi trương nuôi cấy, nguồn nitơ thích hợp là (NH4)2SO4 với lượng tối thích là 3g/l môi trường nuôi cấy, pH = 9 và nhiệt độ là 50oC.
3. Áp dụng kết quả nghiên cứu vào trong quá trình sản xuất nước tương truyền thống chúng ta thấy rằng thời gian ủ mốc xôi để sản xuất nhanh hơn chỉ trong vòng thống chúng ta thấy rằng thời gian ủ mốc xôi để sản xuất nhanh hơn chỉ trong vòng 3 ngày so với sản xuất truyền thống là 7 ngày, chủng thuần khiết an toàn đảm bảo không có Aflatoxin, quy trình sản xuất không tạo 3-MCPD
4. Sau quá trình lên men sản xuất được 15 ngày tính từ khi ngả tương ta thu được kết quả như sau: kết quả như sau:
- Hàm lượng Protein tổng số là 91 g/l - Hàm lượng Nitơ Formol là 4,4 g/l - Hàm lượng Nitơ Formol là 4,4 g/l - Hàm lượng Nitơ axit amin là 0,15 g/l - Hàm lượng Axit axetic là 4,61 g/l
II. KIẾN NGHỊ
Do thời gian trong quá trình lên men chỉ 15 ngày thì hàm lượng Nitơ axit amin thuỷ phân còn ít, vì vậy nếu muốn thuỷ phân triệt để hơn chúng ta cần lên men trong thời gian lâu hơn, sau đó mới phối trộn với phụ gia thực phẩm để tạo mầu ưa thích tuỳ theo sở thích của mỗi dân tộc và khu vực để được xì dầu ngon miệng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Kiều Hữu Ảnh, Giáo trình vi sinh vật học lý thuyết & Bài tập giải sẵn,song ngữ Việt - AnhPhần I, NXB Khoa học và Kỹ thuật 2006.
2. Kiều Hữu Ảnh, Giáo trình vi sinh vật học lý thuyết & Bài tập giải sẵn,song ngữ Việt - Anh Phần II, NXB Khoa học và Kỹ thuật 2007.
3. Kiều Hữu Ảnh, Giáo trình vi sinh vật học lý thuyết & Bài tập giải sẵn,song ngữ Việt - Anh Phần III, NXB Khoa học và Kỹ thuật 2008.
4. Trần Văn Bính, Các phương pháp phân tích hóa lý (Bài giảng dùng cho cao học công nghệ sinh học - Thực phẩm), Đại học Bách Khoa Hà Nội 2008. 5. Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB Khoa học
và Kỹ thuật 2004.
6. Nguyễn Văn Cách, Tin-Sinh học, NXB Khoa học và Kỹ thuật 2005.
7. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Giáo dục, Hà Nội 2002.
8. Bùi Xuân Đồng, Nguyên lý phòng chống Nấm mốc và Mycotoxin, NBX Khoa học và Kỹ thuật 2003.
9. Hoàng Đình Hòa, Tối hóa trong công nghiệp thực phẩm, NXB Khoa học và Kỹ thuật 1999.
10. Lê Văn Hoàng, Các quá trình và Thiết bị công nghệ sinh học trong công nghiệp, NXB Khoa học và Kỹ thuật 2004.
11. Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh, An toàn sinh học, NXB Khoa học và Kỹ thuật 2007. 12. Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thuỷ, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị
Lan Chi, Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB Khoa học và Kỹ thuật 2005.
13. Từ Văn Mặc, Các phương pháp phân tích dùng công cụ, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 2004.
15. Lê Văn Nhương, Quản Văn Thịnh, Kỹ Thuật sản xuất tương và nước chấm, NXB Khoa Học, Hà Nội 1968.
16. Lương Đức Phẩm, Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học và Kỹ Thuật 2005. 17. Trần Thị Thanh, Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục 2007.
18. Nguyễn Xuân Thành(chủ biên), Nguyên Bá Hiên, Hoàng Hải, Vũ Thị Hoan,
Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, NXB Giáo dục 2006.
19. Đặng Thị Thu(chủ biên), Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thuỷ, Nguyễn Xuân Sâm, Công nghệ enzymee, NXB Khoa học và Kỹ thuật 2004. 20. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật, NXB Giáo dục 2006. 21. Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Vân Hải, Động học các quá trình xúc tác sinh
học, NXB Khoa học và Kỹ thuật 2005.
22. Lê Ngọc Tú, Biến hình sinh học các sản phẩm từ hạt, NXB Khoa học và Kỹ thuật 2000.
23. Lê Ngọc Tú, Độc tố học và An toàn thực phẩm, NXB Khoa học và Kỹ thuật 2006. 24. Lê Ngọc Tú, Đỗ Ngọc Liên, Đặng Thị Thu, Tế bào & Các quá trình sinh
học, NXB Khoa học và Kỹ thuật 2002.
Một số luận văn
25. Nguyễn Thi Thu Hiền, Nghiên cứu tạo chế phẩm và sản xuất thử nghiệm Natto, Đồ án tốt nghiệp đại học, Đại Học Bách Khoa Hà Nội năm 2007. 26. Phạm Thị Thanh Huyền, Nghiên cứu chế độ sử dụng phối hợp nấm mốc với
chế phẩm enzymee trong sản xuất tương, Luận văn thạc sỹ chuyên ngành công nghệ các sản phẩm lên men, Đại Học Bách Khoa Hà Nội năm 2002. 27. Nguyễn Thị Hường, Nghiên cứu sản xuất xì dầu theo phương pháp thuỷ
phân bằng kiềm, Đồ án tốt nghiệp đại học chuyên ngành thực phẩm, Trường Đại Học Thuỷ Sản Nha Trang, năm 2005.
28. Sreng Sokvung, Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt lực thuỷ phân cao và ứng dụng trong sản xuất tương, Luận văn thạc sỹ chuyên ngành công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội năm 2003.
Tài liệu tiếng Anh
29. A. S. GRANDISON and M. J. LEWIS, Separation processes in the food and biotechnology industries Principles and Applications, Department of Food Science and Technology University of Reading, UK., Woodhead Publishing Limited Cambridge Englanh, 1996.
30. Alejandro G. Marangoni, Enzymee Kinetics A modern Approach, A John Wiley & Sons, Inc. Publication 2003.
31. Bettelheim & Landesberg, Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry, Harcourt, Inc., 2007.
32. Dilip K. Arora, Paul D. Bridge, Deepak Bhatnagar, Fungal Biotechnology in Agricultural, Food, and Environmental Applications, Marcel Dekker, Inc. 2004. 33. Frederic M. Richards (Yale University, New Haven, Connecticut), David S.
Eisenberg (University of California, California), John Kuriyan (Rockefeller University, New York), Advances in Protein Chemistry, Acadimic Press, An imprint of Elsevier Science, Amsterdam Boston Lodon New York Oxford Paris San Diego San Francisco Singapore Sydney Tokyo, 2003.
34. J. D. Cooley, W. C. Wong, C. A. Jumper, and D. C. Straus, Advances in applied Microbiology Fungi and the Indoor Environment: Their impact on Human Health, Texas Tech University, Elsevier Inc., 2004.
35. James M.Jay, Prefessor Emeritus, Modern Microbiology, AN Aspen Publishers, Inc., 2000.
36. Jonathan Y. Richmond, Robert W. McKinney, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U.S. Government Printing Office Washington 1999. 37. José Luis Barredo, Methods in Biotechnology: Microbial Enzymees and
Biotransformations, Humana Press 2005.
38. Kalidas Shetty, Gopinadhan Paliyath, Anthony Pometto, Robert E. Levin,
Food Biotechnology Second Edition, Taylor & Francis Group, LLC 2006. 39. Martin R. Adams, Fermentation and Food Safety, University of Surrey
40. Michiel Korthals, Paul B. Thomson, Food Biotechnology in Ethical Perspective, Second Edition, Springer Publisher 2007.
41. More Authors, Encyclopedia of Physical Science and Technology- Biotechnology Third Edition, David Pimentel, Cornell University 1997.
42. Patricia L. Traynor, Robert Frederick, Muffy Koch, Biosafety and Risk