Các loài trong chi Crinum được quan tâm do có nhiều tác dụng sinh học. Nhóm được chú ý nhiều nhất là alcaloid [52], [58], [107], [116], kế đến là flavonoid [31], [103].
- Trước đây, các loài này được sử dụng như thuốc cổ truyền:
Thân hành và lá tươi của các loài C. amabile, C. asiaticum, C. defixum, C. giganteum điều trị các chứng mụn nhọt, sưng lở, sưng do viêm [4], [21], [58].
Cao cồn và cao nước chiết từ thân hành của loài C. zeylanicum được sử dụng như vị thuốc cổ truyền trong điều trị các chứng viêm, vết thương mưng mủ, trị rắn cắn. Dịch ép từ lá tươi dùng để trị chứng đau tai [107], [125].
- Các công trình khoa học cho thấy các loài trong chi Crinum thể hiện hoạt tính sinh học chung của họ Amaryllidaceae [52], [107], [116] như sau:
1.3.1.1. Tác dụng kháng acetylcholinesterase:
- Thử nghiệm sàng lọc khả năng kháng acetylcholinesterase bằng phương pháp SKLM, chất đối chiếu galantamin trên 15 mẫu cao methanol từ thân hành của 15 loài trong họ Amaryllidaceae. Kết quả cho thấy cao chiết C. powellii và Amaryllis belladonna ở nồng độ 10 mg/ml thể hiện hoạt tính cao nhất [117].
- Cao thân hành của loài C. bulbispermum có khả năng kháng acetylcholinesterase với IC50 = 0,14 ± 0,039 àg/ml và C. moorei với IC50 = 21,5 ± 8,40 àg/ml. Hoạt tớnh này được giải thích là do thành phần alcaloid [34], [51].
- Cao methanol từ thân hành của loài C. jagus (45,1%) và C. glaucum (40,8%) ở nồng độ 100 àg/ml. Tớnh khỏng acetylcholinesterase cú liờn quan đến sự hiện diện của nhóm hydroxy trong cấu trúc của alcaloid [66].
1.3.1.2. Tác dụng chống oxi hóa:
- Liều 200 mg/kg, cao ethanol của loài C. asiaticum làm giảm lượng đường trong máu, giảm cholesterol, triglycerid được quan sát sau 15 ngày điều trị. Đồng thời, các chỉ số men gan đều giảm chứng tỏ cao chiết có thể bảo vệ tế bào gan theo cơ chế chống oxi hóa trên mô gan của chuột bị tiểu đường [71].
- Cao methanol C. moorei chống oxi húa với EC50 = 5,06 ± 1,54 (àg/ml) tương đương với vitamin C EC50 = 5,06 ± 0,2 (àg/ml) [51].
- Cao ethanol C. defixum có 79,01% hoạt tính chống oxi hóa so với vitamin C là 82,71% và quercetin 85,19% cựng liều thử nghiệm (25 àg/ml) [94].
- Cao chiết từ C. jagus nồng độ 50 μg/ml có % chống oxi hóa là 81,47 ± 0,3 trong khi Vitamin C 74,1 ± 0,1 [108].
- Hỗn hợp các alcaloid như haemanthamin, crinamin, lycorin, hamayne được chứng minh có hoạt tính kháng oxi hóa cao hơn khi khảo sát riêng lẻ và thấp hơn so với cao ethanol toàn phần ban đầu [110].
- Cao nước C. bulbispermum có chỉ số kháng oxi hóa là 42,08 ± 2,25 so với chất đối chứng dương butylated hydroxy toluen 77,22 ± 1,27 (0,1 mg/ml) [113].
Các tác giả đều cho rằng hoạt tính chống oxi hóa là do vai trò của nhóm flavonoid và tanin có trong cây.
1.3.1.3. Tác dụng kháng viêm:
Các thử nghiệm đều thực hiện trên động vật là chuột, mẫu thử là cao chiết nước hoặc methanol từ thân hành.
- Hoạt tính kháng viêm theo các cơ chế khác nhau: cao methanol C. asiaticum theo cơ chế kháng histamin ở liều 50 mg/kg khi thực nghiệm trên chuột; cao C. moorei kháng enzym COX-1 (IC50 = 99,2 ± 0,96) và COX-2 (IC50 = 75,5 ± 1,5) [51].
- Hoạt tính kháng viêm của cao nước từ thân hành C. giganteum liều 200 mg/kg tương đương với diclofenac liều 5 mg/kg [77].
- Cao chiết nước C. glaucum liều 400 mg/kg ức chế 60,78% cơn dị ứng phế quản trên chuột thử nghiệm, chất đối chứng natri cromoglycat là 70,41% (50 mg/kg) [109].
1.3.1.4. Tác dụng giảm đau:
Cao nước chiết từ thân hành cùa loài C. bulbispermum thể hiện khả năng giảm đau theo cơ chế giảm đau opioid [113], C. giganteum liều uống 200 mg/kg ức chế cơn đau khi so sánh với aspirin [77]; phân đoạn alcaloid của loài C. augustum thể hiện
1.3.2. Tác dụng sinh học và công dụng của TNHC (Crinum latifolium L.) Dân gian sử dụng TNHC như thuốc cổ truyền: thân hành hoặc lá TNHC được xào nóng hoặc giã đắp bên ngoài trong điều trị đau khớp, mụn nhọt, áp xe mưng mủ [1].
Dịch ép từ lá làm thuốc trị đau tai [52]. Dịch chiết nước được sử dụng để chữa ung thư vú, ung thư tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư hầu họng, chữa bệnh đường tiêu hóa, trị viêm họng [1], [4].
Rất nhiều công trình khoa học công bố về hoạt tính sinh học của loài này trên cả in vitro và in vivo. Phần lớn các công trình do tác giả Việt Nam hoặc phối hợp với tác giả nước ngoài, được thực hiện trên cao chiết từ lá TNHC và các sản phẩm có TNHC.
Các tác dụng được công bố là tính kháng khối u, kháng viêm, kháng oxi hóa và kích thích miễn dịch.
Các công trình nghiên cứu tác dụng sinh học của TNHC như sau:
- Cao methanol chiết từ lá ức chế NF-κB, quá trình này liên quan đến tính kháng viêm và kháng ung thư [103].
- Cao methanol và cao nước chiết từ rễ, thân hành lá và cao alcaloid của TNHC ức chế sự phân bào trên mô hình Allium Test, độc đối với tế bào trên mô hình Brine Shrimp Test. Kết quả được so sánh với chất đối chứng colchicin [11].
- Trên mô hình gây ung thư thực nghiệm trên chuột bằng cách cấy truyền tế bào ung thư sarcoma TG-180: cao cồn và cao alcaloid ngăn chặn hiệu quả giai đoạn sinh và phát triển của tế bào ung thư [11].
- Cao chiết bằng nước nóng có tác dụng kích thích sự sinh sản của tế bào lympho T trong thử nghiệm invitro trên bạch cầu đơn nhân to ngoại vi lấy từ máu ngoại vi người.
Trong thử nghiệm in vivo, tác dụng cũng tương tự: kích thích sự sinh sản và hoạt hóa tế bào lympho T trong máu ngoại vi chuột [139]. Đồng thời cao chiết này cũng ức chế sự phát triển của tế bào sarcoma thực hiện trên chuột [107], hoạt tính kháng oxi hóa, kháng viêm in vitro [95].
- Ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và hồi phục chức năng miễn dịch in vitro là hai hiệu quả đáng chú ý khi giải thích tính kháng ung thư của cao chiết từ lá Crinum latifolium [95].
- Bệnh viện hữu nghị Việt Xô đã điều trị cho 158 bệnh nhân bị u tuyến tiền liệt và u xơ tử cung từ dịch chiết lá TNHC, trên 60% bệnh nhân được chữa khỏi [16].
- Sản phẩm Crillin T chứa thành phần alcaloid và flavonoid của TNHC được thử nghiệm trên tế bào lympho người bình thường và bệnh nhân ung thư vòm mũi họng bị suy giảm miễn dịch. Kết quả cho thấy số lượng tế bào lympho T tăng gần với nhóm sử dụng levamisol hoặc mạnh hơn levamisol khi thử trên tế bào lympho bệnh nhân đã có suy giảm miễn dịch [31].
- Sản phẩm Panacrin có thành phần TNHC và một số dược liệu khác được nghiên cứu lâm sàng về tác dụng bổ dưỡng (tăng lực, tăng trọng, tăng tính vận động trên chuột suy dinh dưỡng); chế phẩm có độ an toàn cao [25]. Sử dụng Panacrin trong hỗ trợ điều trị ung thư dạ dày sau phẫu thuật cho hiệu quả rõ rệt: các chỉ tiêu về trọng lượng cơ thể, huyết học có sự khác biệt có ý nghĩa giữa nhóm chứng và nhóm nghiên cứu, thuốc được dung nạp tốt [18].
- Viên nang TNHC tác dụng điều trị rối loạn tiểu tiện ở bệnh nhân phì đại lành tính tuyến tiền liệt, kết quả đạt trên 96%. Thuốc không gây biến đổi chỉ số sinh lý, huyết học, hóa sinh, chức năng gan, thận, tuần hoàn, máu cũng như chưa gây tác dụng không mong muốn ở hệ tiêu hóa, thần kinh trung ương và thần kinh thực vật [19].
- Viên Tadimax có thành phần chính là cao chiết từ lá TNHC và một số dược liệu khác cải thiện rối loạn tiểu tiện của chứng phì đại lành tính tuyến tiền liệt. Thử lâm sàng so sánh với Tadenan trên 157 bệnh nhân: đáp ứng tốt 42%, khá 48%. Thuốc tác dụng phụ trên hệ tiêu hóa, mẫn ngứa, chóng mặt (10%). Các biến đổi về tim mạch, huyết học, sinh hóa sau 2 tháng điều trị đều trong giới hạn bình thường [26].
- Crilin T là sản phẩm mới từ TNHC có tác dụng tăng cường miễn dịch tương đương levamisol hay mạnh hơn levamisol. Thành phần của Crilin T bao gồm các alcaloid và flavonoid của Trinh nữ Crila. Nghiên cứu được tiến hành trực tiếp trên các tế bào lympho tách từ người bình thường về lâm sàng và từ các bệnh nhân ung thư vòm mũi họng và nuôi cấy in vitro 48 giờ. Đáp ứng với mẫu thử nghiệm của tế bào lympho bị suy giảm miễn dịch mạnh hơn đáp ứng của tế bào lympho người bình thường [31].
Tác dụng sinh học của một vài hợp chất tinh khiết được phân lập từ TNHC:
Các hợp chất alcaloid:
Alcaloid kiểu khung crinin:
- Các thử nghiệm sàng lọc sinh học chứng tỏ crinamin và haemanthamin có hiệu quả trong thử nghiệm gõy chết tế bào ung thư theo chương trỡnh ở nồng độ àM. Cầu nối α ở vị trí C-2 và nhóm –OH tự do ở C-11 là những vị trí đóng vai trò quan trọng trong tác dụng dược lý này [96].
- Pratorimin và undulatin kháng lại sự phát triển của các tế bào gây ung thư phổi trên chuột thực nghiệm [58].
- Crinafolin và crinafolidin: hoạt tính kháng khối u, làm giảm sự tăng trưởng của tế bào u báng S-180 trên thử nghiệm in vivo trên chuột [61].
- Lycorin, crinamin và 6-hydroxycrinamin tách từ thân hành loài C. delagoense chống lại tế bào ung thư BL-6 trên chuột [101].
- Crinin và 6-hydroxybuphanidrin kháng sự tăng sinh tế bào, hiệu quả trong việc chống lại sự tăng sinh dòng tế bào ung thư người HL-60 và MDA-MB-23 [38].
- Các alcaloid crinin, 6-hydroxybuphanidrin và 6-ethoxybuphanidrin chống lại sự tăng sinh trên các dòng ung thư người [123].
Alcaloid kiểu khung lycorin:
Đại diện là lycorin, alcaloid được tìm thấy trong rất nhiều loài của họ Amaryllidaceae.
Nhiều công trình nghiên cứu hoạt tính của lycorin cho thấy alcaloid này có nhiều tác dụng như kháng acetylcholineseterase, kháng ung thư, kháng viêm, kháng oxi hóa:
- Lycorin hydroclorid ngăn chặn một cách chọn lọc và đồng thời sự phát triển của tế bào ung thư buồng trứng (dòng Hey1B). Kết quả nghiên cứu này hứa hẹn một liệu pháp điều trị ung thư mới [39].
- Ức chế sinh tổng hợp protein và DNA trong tế bào chuột, kiềm hãm sự tăng trưởng in vivo của khối u, làm giảm khả năng sống của tế bào ung thư [58].
- Với các dòng tế bào ung thư như Hep-G2 (ung thư gan), FI (ung thư màng tử cung), RD (ung thư màng tim), lycorin đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào với IC50 là
0,15 àg/ml. Cỏc nhúm hydroxy ở vị trớ C1 và C2 đúng vai trũ quan trọng đối với hoạt tính này vì các hợp chất 1,2-di-O-acetyllycorin và lycorin-1,2-di-O-β-D-glucosid không còn hoạt tính [9].
- Hoạt tính kháng acetylcholineseterase in vitro được xác định bằng phương pháp quang phổ với thuốc thử Ellman, IC50 = 29,3 ± 3,15 (μg/ml), chất đối chứng physostigmin IC = 1,51 μg/ml [49].
- Lycorin cũng can thiệp vào sự tổng hợp acid ascorbic ở chuột thử nghiệm, chuột bị xuất huyết dưới da khi tiờm lycorin liờn tiếp trong 10 ngày với liều 10 àg/g. Hiện tượng này mất đi nếu tiêm bổ sung acid ascorbic [46].
- Hoạt tính kháng viêm, giảm đau, bảo vệ gan của lycorin được thử nghiệm trên chuột.
Kết quả khảo sát cho thấy % hoạt tính giảm đau ở nồng độ 1 mg/kg là 11,30 ± 2,61 (%), so với morphin 10 mg/kg 51,91 ± 10,57 (%).
- Hoạt tính bảo vệ tế bào gan nồng độ 2 mg/kg với các thông số ALT và AST (U/l) lần lượt là 348,0 ± 204,4 và 390,0 ± 131,6; so sánh với carbon teatrclorid 0,8 mg/kg lần lượt là 959,4 ± 152,1 và 1931,9 ± 303,6 [43], [76].
- Tác dụng kháng sinh tổng hợp tế bào eukaryotic [74], kháng ký sinh trùng sốt rét [80], kháng virus [52].
- Bảo vệ gan chống tác động gây oxi hóa bởi CCl4 (5 mg/kg) được thử nghiệm trên chuột, chất đối chứng là silymarin [69], [70].
- Lycorin, homolycorin và haemanthamin kháng HIV với IC50 = 0,4-7,3 μg/ml [124].
- 1-O-acetyllycorin gõy độc tế bào IC50 = 4,5 àg/ml trờn dũngHep-G2 [9].
- Hippadin tác động giảm khả năng thụ thai trên chuột khi tác động ức chế thuận nghịch trên tế bào mầm của chuột cống đực ở giai đoạn trước khi sinh tinh [53].
- 1,2-β-epoxy ambellin liều 5 àg/ml chất này cú tỏc dụng điều hũa lympho bào lỏ lỏch chuột. Hỗn hợp của ambellin và 1,2-β-epoxyambellin chống phân bào được so sánh với chất đối chiếu concavalin [56].
- Hippadin và 6α-hydroxybuphanisin gây độc tế bào khi thử nghiệm trên tế bào bạch cầu T4 [52].
Các hợp chất non-alcaloid:
- Isoquercitrin thể hiện khả năng chống oxi hóa được xác định bằng phương pháp đỏnh bắt gốc tự do với thuốc thử DPPH, IC50 = 17,9 ± 1,7 (àM/l); khỏng tyrosinase với % ức chế 54,55 ở nồng độ 1000 àM [138].
- Astragalin thể hiện hoạt tính kháng viêm gây ra bởi lipopolysaccharid trên phổi chuột bị tổn thương. Sáu giờ sau khi tiêm lipopolysaccharid, nồng độ các cytokin như TNF-a, interleukin-1 (IL-1) và interleukin-6 (IL-6) từ trong dịch phổi tăng đột ngột.
Tuy nhiên, khi chuột được điều trị dự phòng với astragalin (50 – 75 mg/kg) thì các cytokin này giảm một cách tuyến tính theo liều sử dụng [122]. Astragalin còn có tác động chống lại gốc tự do gây tán huyết trên tế bào hồng cầu người [41].
- Kaempferol là hợp chất polyphenol chống oxi hóa được tìm thấy trong nhiều loài thực vật, nhiều nghiên cứu cho thấy kaempferol làm giảm nguy cơ các bệnh mãn tính đặc biệt là ung thư. Kaempferol giúp cơ thể chống lại gốc tự do liên quan đến sự phát triển của bệnh ung thư và ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư. Ở cấp độ phân tử, kaempferol được cho là có thể điều chỉnh một số yếu tố quan trọng trong truyền tín hiệu của tế bào liên quan đến quá trình apoptosis, sự hình thành mao mạch, quá trình kháng viêm và sự di căn của tế bào [35].
- 4-senecioyloxymethyl-3,4-dimethoxycoumarin ức chế mạnh dòng tế bào HUVEC in vitro, tỷ lệ ức chế là 53,5% ở nồng độ 1 àg/ml [104].
- Glucan A và glucan B bảo vệ sự giảm bạch cầu do ảnh hưởng của các tác nhân như Tween-80 gây ra. Kết quả này giải thích việc sử dụng cao chiết toàn phần từ C.
latifolium trong việc điều trị rối loạn dị ứng [60].
- Lectin không thể hiện kháng các dòng tế bào ung thư trên người. Tuy nhiên thể hiện tính kháng khuẩn in vitro, kháng lại sự tái tổ hợp poxvirus [79].
- Esculetin gây tăng miễn dịch trên hệ thống đại thực bào và tế bào lympho ở thử nghiệm in vivo và in vitro trên chuột, đây cũng là cơ chế tác động kháng ung thư của nhóm hợp chất coumarin nói chung [85].
1.4. CHIẾT CAO TOÀN PHẦN TỪ DƯỢC LIỆU BẰNG DUNG MÔI CO2 LỎNG SIÊU TỚI HẠN
- Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy chất tan ra khỏi mô thực vật.
Tùy mục đích sử dụng và tùy điều kiện trang thiết bị mà lựa chọn kỹ thuật chiết thích hợp. Nhưng phải đảm bảo yêu cầu chiết được tối đa hoạt chất và tối thiểu tạp chất.
Ngoài các kỹ thuật chiết ngấm kiệt hay ngâm, các kỹ thuật chiết siêu âm, vi sóng, chiết với dung môi lỏng siêu tới hạn, chiết áp suất cao đã được phát triển để nâng cao chất lượng và hiệu quả của sản phẩm [30].
- Thử nghiệm so sánh phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm, vi sóng, phương pháp SFE cho thấy chúng đều có hiệu suất chiết cao hơn so với chiết ngấm kiệt [111]. Hiện nay đã có những thiết bị chiết xuất qui mô lớn, tuy nhiên việc ứng dụng chưa phổ biến, phần lớn chúng được sử dụng để chuẩn bị mẫu để phân tích bằng các phương pháp SKLM, HPLC [87], [135], CE [136], UPLC [131].
- Chiết xuất bằng dung môi lỏng siêu tới hạn (phương pháp SFE): là phương pháp chiết bằng các chất lỏng siêu tới hạn đã được ứng dụng thành công trong nhiều lĩnh vực môi trường, dược phẩm, thực phẩm và hợp chất tự nhiên. Hiện nay công nghệ này được sử dụng phổ biến để chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học. Phương pháp này có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp truyền thống, đặc biệt là sản phẩm chiết không chứa dung môi [37]. Nguyên lý cơ bản phương pháp chính là độ hòa tan của các chất cần chiết vào dung môi ở nhiệt độ và áp suất tại đó dung môi ở trạng thái siêu tới hạn [6].
Trong công nghệ SFE, dung môi thông dụng nhất là CO2 [47]. Đây là dung môi được FDA và EFSA công nhận về mức độ thân thiện với môi trường [65]. Ở nhiệt độ và áp suất thông thường CO2 ở trạng thái khí. Nhưng khi nhiệt độ trên 31,1 oC và áp suất trên 73,9 bar, CO2 rơi vào vùng trạng thái siêu tới hạn. Tại điều kiện này tỷ trọng của hai pha lỏng-khí bằng nhau, ranh giới phân biệt giữa 2 pha biến mất. Lúc này CO2
mang đặc tính của cả chất lỏng và chất khí [91], [97], [99], trạng thái vật lý này được mô tả như một chất lỏng rất lưu động nên còn gọi là lưu chất [6].
- Ứng dụng SFE với dung môi CO2 lỏng đã được ứng dụng để chiết xuất nhiều nhóm hợp chất tự nhiên như tinh dầu [40], lipid [119], phenolic [120], saponin [121], coumarin [118], flavonoid [90], thuốc cổ truyền [75], [137]. SFE cũng được sử dụng như phương pháp chiết hay làm sạch thuốc trừ sâu các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu [75], [86].
Ngoài trang thiết bị tốn kém và vận hành phức tạp, nhược điểm lớn nhất của SFE là cần phải thực hiện nhiều khảo sát để tìm các thông số tối ưu áp suất, thời gian, nhiệt độ, khối lượng mẫu, dung môi hỗ trợ và tỷ lệ dung môi hỗ trợ [23].
- Phần lớn alcaloid tồn tại trong thực vật đều ở dạng muối, đây là trở ngại lớn khi ứng dụng phương pháp SFE để chiết xuất. Vì vậy hầu hết các công trình nghiên cứu về chiết xuất alcaloid đều phải sử dụng dung môi hỗ trợ. Các dung môi hỗ trợ thông dụng được khảo sát là methanol, ethanol và nước [64], [89], [99], [128].
Các base hữu cơ như methylamin, diethylamin, tetrahydrofural cũng thường được nghiên cứu để tăng khả năng hòa tan của alcaloid dạng base sẽ phù hợp hơn trong chiết alcaloid bằng phương pháp SFE [82].
- Để chiết alcaloid của loài Scopolia japonica cần phải thêm diethylamin mới cải thiện hiệu suất chiết hyoscyamin và scopolamin [42].
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG
1.5.1. Các phương pháp sắc ký ứng dụng phân lập hợp chất tinh khiết - Hai phương pháp thông dụng được sử dụng để phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao toàn phần là sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng điều chế [8], [9][11], [33], [57], [83], [84]; kết hợp sắc ký lỏng trung áp và sắc ký cột nhanh để tách phân đoạn, các hợp chất tinh khiết từ các phân đoạn được kết tinh lại trong dung môi [9].
Chất hấp phụ thông dụng nhất là silica gel, hoặc Sephadex LH-20 để tách các hợp chất có phân tử lượng lớn [8]. Rửa giải bằng hỗn hợp dung môi từ ether dầu hỏa, n–
hexan, cloroform, ethyl acetat đến methanol.