CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.3. Thiết lập chất đối chiếu
Các hợp chất được chọn để thiết lập (CĐC) gồm 4 alcaloid là hippadin, lycorin, crinamidin và 6-hydroxycrinamidin; 2 flavonoid là astragalin và isoquercitrin.
3.3.1. Xây dựng phương pháp đánh giá nguyên liệu thiết lập CĐC 3.3.1.1. Xác định độ tinh khiết bằng SKLM
Dung môi khảo sát alcaloid:
Hệ dung môi 1: cloroform – methanol – amoniac 25% (6 : 1 : 0,05)
Hệ dung môi 2: cloroform – ethyl acetat – methanol – amoniac (3:3:1:0,05) Hệ dung môi 3: aceton – toluen – ethanol – amoniac 25% (9 : 7: 1 : 0,05) Dung môi khảo sát flavonoid:
Hệ dung môi 1: ethyl acetat – aceton – acid formic (4: 1: 0,1) Hệ dung môi 2: cloroform – methanol – acid formic (4: 1: 0,1)
Hệ dung môi 3: ethyl acetat – acid formic – acid acetic – nước (10: 7: 7: 7) Vết alcaloid dương tính với TT Dragendorff, flavonoid dương tính với TT FeCl3 1%.
3.3.1.2. Xác định độ tinh khiết và hàm ẩm bằng phân tích nhiệt trọng lượng Bảng 3.12: Kết quả khảo sát độ tinh khiết; hàm ẩm bằng phân tích nhiệt trọng lượng.
Tên CĐC Độ tinh khiết TB (%) Hàm ẩm (%)
Crinamidin 99,74 Không phát hiện*
6-hydroxycrinamidin 97,53 Không phát hiện
Lycorin 98,86 Không phát hiện
Hippadin 98,87 Không phát hiện
Astragalin 98,03 Không phát hiện
Isoquercitrin 98,51 Không phát hiện
3.3.1.3. Xác định độ tinh khiết bằng HPLC - Điều kiện sắc ký:
- Cột: C8 Phenomenex (250 x 4,6 mm; 5 m) - Nhiệt độ cột: 40 oC - Bộ phận phát hiện: đầu dò PDA - Tốc độ dòng: 1 ml/phút
Thành phần pha động và bước sóng phát hiện của mỗi quy trình như sau:
Bảng 3.13: Thành phần pha động và bước sóng phát hiện của quy trình xác định độ tinh khiết của các nguyên liệu CĐC bằng phương pháp HPLC.
Tên chất khảo sát Thành phần và tỷ lệ pha động Bước sóng (nm) Crinamidin Methanol – acid phosphoric pH 3 (35 : 65) 214 6-hydroxycrinamidin Methanol – acid phosphoric pH 3 (35 : 65) 214 Lycorin Methanol – acid phosphoric pH 3 (10 : 90) 289 Hippadin Methanol – acid phosphoric pH 3 (70 : 30) 297 Astragalin Acetonitril – acid phosphoric pH 4 (25 : 75) 265 Isoquercitrin Acetonitril – acid phosphoric pH 4 (25 : 75) 256 - Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống:
Bảng 3.14: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC.
Tên chất Thời gian lưu (phút)
Hệ số bất đối (0,8 ≤AF ≤1,5)
Diện tích (àV x giõy) (RSD ≤ 2%)
Độ phân giải Rs ≥ 1,5
Crinamidin 4,5
(RSD = 0,3%) 1,3 7199959
(RSD= 0,5%)
pic trước 6,6 pic sau 2,4 6-hydroxycrinamidin 3,7
(RSD = 0,4%) 1,2 14572520
(RSD= 0,7%)
pic trước 3,4 pic sau 3,7
Lycorin 5,0
(RSD = 0,2%) 1,3 905188
(RSD= 0,2%) pic trước 4,7
Hippadin 9,1
(RSD = 0,4%) 1,1 6625128
(RSD= 0,2%) Pic trước 9,6
Astragalin 7,9
(RSD 0,5%) 1,0 2625605
(RSD= 0,6%) pic sau 2,1
Isoquercitrin 4,6
(RSD 0,6%) 1,2 1716515
(RSD=0,03%) pic sau 5,2 Nhận xét: các quy trình phân tích đều đạt tính phù hợp hệ thống.
- Thẩm định quy trình quy trình xác định độ tinh khiết nguyên liệu CĐC bằng HPLC Tính đặc hiệu: SKĐ mẫu trắng không có tín hiệu tại vị trí thời gian lưu của pic chính trên SKĐ mẫu thử.
Tính tuyến tính: tiến hành sắc ký 6 mẫu thử tương ứng với 6 nồng độ của mỗi chất (10; 20; 50; 100; 250; 500 àg/ml). Mỗi nồng độ thực hiện 2 lần.
Phương trình hồi qui và hệ số tương quan như sau:
Crinamidin: Y = 70299x R2 = 0,9994 6-hydroxycrinamidin: Y = 149967x R2 = 0,9996
Lycorin: Y = 9088x R2= 0,9999
Hippadin: Y = 58426x R2 = 0,9990 Astragalin: Y = 21716x R2 = 0,9969 Isoquercitrin: Y = 17244x R2 = 0,9991
Nhận xét: có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các CĐC trong khoảng nồng độ khảo sát (R2 > 0,998).
Độ chính xác:
Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) bằng phương pháp HPLC:
- Sắc ký đồ của CĐC crinamidin có 1 pic chính chiếm 98,71% (RSD = 0,02%) và 5 pic tạp chiếm 1,29% tổng diện tích pic trên sắc ký đồ.
Hình 3.7: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC crinamidin bằng HPLC.
- Sắc ký đồ của 6-hydroxycrinamidin: 1 pic chính chiếm 96,78% (RSD = 0,08%) và 2 pic tạp chiếm 3,22% tổng diện tích pic trên sắc ký đồ.
Hình 3.8: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC 6-hydroxycrinamidin HPLC.
-Sắc ký đồ CĐC lycorin cho 1 pic chính chiếm 99,99% (RSD = 0,03%) và 1 pic tạp chiếm 0,01% tổng diện tích pic trên sắc ký đồ.
Hình 3.9: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC lycorin bằng HPLC.
- Sắc ký đồ của CĐC hippadin có 1 pic chính chiếm 99,92% (RSD = 0,02%) và 2 pic tạp chiếm 0,08% tổng diện tích pic trên sắc ký đồ.
Hình 3.10: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC hippadin bằng HPLC.
- Sắc ký đồ của CĐC astragalin có 1 pic chính chiếm 98,29% (RSD = 0,11%) và 1 pic tạp chiếm 1,71% tổng diện tích pic trên sắc ký đồ.
- Sắc ký đồ của isoquercitrin có pic chính chiếm 98,12% (RSD = 0,03%) và 2 pic tạp chiếm 1,88% tổng diện tích pic trên sắc ký đồ.
Hình 3.12: SKĐ xác định độ tinh khiết của CĐC isoquercitrin bằng HPLC.
Bảng 3.15: Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các CĐC bằng HPLC.
Tên chất đối chiếu Độ tinh khiết sắc ký (%); RSD%
Crinamidin 98,71% (RSD% = 0,02) 6-hydroxycrinamidin 96,78 % (RSD% = 0,08) Lycorin 99,99% (RSD% = 0,03) Hippadin 99,92% (RSD% = 0,02) Astragalin 98,29% (RSD% = 0,11) Isoquercitrin 98,12% (RSD% = 0,03)
RSD% của độ tinh khiết sắc ký các pic chính giữa các lần tiêm cùng nồng độ < 2%.
Nhận xét: các quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký đạt yêu cầu về độ chính xác.
Độ đúng: chưa thực hiện được vì hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia chưa phân phối các chất đối chiếu gốc (PCRS) này.
3.3.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đánh giá các nguyên liệu CĐC 3.3.2.1. Tính chất
- Các alcaloid crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, lycorin và hippadin là bột kết tinh màu trắng. Các flavonoid astragalin và isoquercitrin là bột kết tinh màu vàng.
3.3.2.2. Điểm chảy
Thực hiện theo hướng dẫn DĐVN IV - Phụ lục 6.7, kết quả trình bày ở Bảng 3.16.
3.3.2.3. Định tính:
- Phổ UV-Vis: mẫu được hũa tan trong methanol, nồng độ 10 àg/ml. Quột phổ trong khoảng bước sóng từ 200 – 800 nm. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.16.
- Phổ MS: xác định pic cơ bản (m/z). Kết quả được trình bày ở Bảng 3.16.
- Phổ IR: dập viên KBr. Xác định các dao động đặc trưng. Kết quả ở Bảng 3.17.
- Phổ NMR: xem Mục 3.2.3.
Bảng 3.16: Dữ liệu phổ UV-Vis, MS và điểm chảy của các CĐC.
Tên chất khảo sát Phổ UV-VIS (λmax, nm)
Điểm chảy
oC
Phổ MS (Pic cơ bản)
Crinamidin 286 223 ± 2 oC 318,46 [M+H]+
6-hydroxycrinamidin 286 253 ± 2 oC 334,36 [M+H]+
Lycorin 238 và 288 285 ± 2 oC 288,44 [M+H]+
Hippadin 247; 297 và 349 230 ± 2 oC 286,31 [M+Na]+ Astragalin 266 và 349 181 ± 2 oC 471,31[M+Na]+ Isoquercitrin 257 và 357 227 ± 2 oC 487,33[M+Na]+ Bảng 3.17: Dữ liệu phổ IR của các CĐC.
Tên chất khảo sát Các dao động đặc trưng (KBr, υ cm-1) Crinamidin 802, 1241, 1473; 1046; 1278; 1616; 3200 6-hydroxycrinamidin 804, 1244, 1494; 1037; 1286;1616; 3508
Lycorin 1018; 1278; 1500; 3333
Hippadin 1029; 1674; 1618
Astragalin 1654; 1068; 3284
3.3.2.4. Xác định độ tinh khiết sắc ký:
Thực hiện phương pháp HPLC, tiến hành theo Mục 3.3.1.3
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: tiến hành sắc ký 6 lần mẫu thử.
RSD% của thời gian lưu, diện tích của các pic trên sắc ký đồ thu được phải < 2%, Rs giữa pic chính và pic tạp ≥ 1,5.
Kết quả: được trình bày ở Bảng 3.14, các quy trình đều đạt tính phù hợp hệ thống.
Tiến hành xác định % độ tinh khiết sắc ký của pic chính: tiêm vào hệ thống dung dịch mẫu thử. Diện tích của pic chính phải lớn hơn 95,0% và các pic phụ có tổng diện tích pic phải dưới 5,0% so với tổng diện tích pic trên sắc ký đồ tính theo nguyên trạng.
Bỏ qua pic của pha động và pic có S/N < 2/1.
Kết quả: được trình bày ở Bảng 3.15, tất cả 6 nguyên liệu được chọn thiết lập CĐC đều đạt yêu cầu của chất đối chiếu hóa học thứ cấp dùng cho phép thử định lượng.
3.3.3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đánh giá các CĐC
Các chất khảo sát được xây dựng tiêu chuẩn đánh giá như CĐC hóa học thứ cấp dùng cho phép thử định lượng.
Các chỉ tiêu, yêu cầu chất lượng và phương pháp thử tương tự như tiêu chuẩn đánh giá nguyên liệu thiết lập CĐC tương ứng ở Mục 3.3.2. Riêng chỉ tiêu Định tính chỉ cần thực hiện phương pháp phổ IR.
(Tiêu chuẩn cơ sở của các CĐC đã được Viện Kiểm Nghiệm thuốc TpHCM thẩm định, nội dung của mỗi tiêu chuẩn được trình bày ở Phụ Lục 2).
3.3.4. Đóng gói và đánh giá đồng nhất lô
- Đóng gói:chất khảo sát được đóng trong các lọ thủy tinh màu nâu.
Khối lượng nguyên liệu ban đầu: 600 mg.
Khối lượng đóng mỗi lọ: 5 mg.
Tổng số lọ đóng của mỗi chất: 100 lọ.
Sau khi đóng, các ống đối chiếu được bảo quản ở nhiệt độ ổn định từ 2 – 8 oC.
- Đánh giá đồng nhất lô: số lọ cần đánh giá: 11 lọ. Mỗi lọ được phân tích 2 lần trên cùng một phương pháp đã được thẩm định. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.18.
Bảng 3.18: Kết quả đánh giá đồng nhất lô của các CĐC sau khi đóng gói.
Số TT
Độ tinh khiết sắc ký TB giữa 2 lần phân tích (%)
Crinamidin 6-OHcri. Hippadin Lycorin Astra. Isoquer.
1 98,69 96,72 99,96 99,99 98,23 98,02
2 98,70 96,75 99,98 99,99 98,27 98,07
3 98,67 96,76 99,98 100,00 98,26 98,11
4 98,72 96,73 99,99 100,00 98,30 98,13
5 98,73 96,74 99,93 100,00 98,30 98,09
6 98,76 96,75 99,95 99,99 98,29 98,10
7 98,70 96,72 99,91 100,00 98,31 98,15
8 98,74 96,76 99,98 100,00 98,25 98,11
9 98,71 96,75 99,93 99,99 98,27 98,15
10 98,69 96,79 99,93 99,99 98,30 98,14
11 98,70 96,81 99,99 100,00 98,26 98,10
TB 98,71% 96,75% 99,96% 99,99% 98,28 98,10
RSD 0,03% 0,03% 0,03% 0,01% 0,02% 0,04%
Ghi chú: 6-OHcri.: 6-hydroxycrinamidin Astra.: astragalin
Isoquer.: isoquercitrin
Kết quả được đánh giá bằng phân tích thống kê ANOVA một yếu tố:
Crinamidin: Ftn = 0,294 6-hydroxycrinamidin: Ftn = 2,137 Hippadin: Ftn = 2,150
Lycorin: Ftn = 1,148
Astragalin: Ftn = 0,695 Isoquercitrin: Ftn = 2,661
Nhận xét: các giá trị Ftn < Flt = 2,853; quá trình đóng gói không ảnh hưởng đến kết quả xác định độ tinh khiết của CĐC.
3.3.5. Đánh giá đồng nhất liên phòng thí nghiệm
Các lọ CĐC được đánh giá tại 3 phòng thí nghiệm đạt GLP hoặc ISO 17025:
- Khoa Thiết lập chất chuẩn và Chất đối chiếu – Viện KNT TpHCM (PTN 1).
- Khoa Vật lý đo lường hoặc Khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm - Viện KNT TpHCM (PTN 2).
- Khoa kiểm nghiệm thuốc – Trung tâm kiểm nghiệm - Sở Y tế tỉnh Vĩnh Long hoặc Khoa kiểm nghiệm thuốc – Trung tâm kiểm nghiệm - Sở Y tế tỉnh Bình Dương (PTN3).
Mỗi PTN nhận 6 lọ CĐC và quy trình phân tích.
Độ đồng nhất liên PTN được đánh giá bằng phép thống kê ANOVA một yếu tố trên 18 kết quả định lượng của 3 PTN tham gia đánh giá.
Kết quả đánh giá liên phòng thí nghiệm và phiếu kiểm nghiệm của các PTN được trình bày ở Phụ lục 2.
Các giá trị Ftn và Flt được tính từ các kết quả độc lập của các phòng thí nghiệm:
Crinamidin: Ftn= 3,074 6-hydroxycrinamidin: Ftn = 1,029 Hippadin: Ftn = 2,188 Lycorin: Ftn = 0,814 Astragalin: Ftn = 1,543 Isoquercitrin: Ftn = 2,445 Nhận xét: các giá trị Ftn < Flt = 3,682.
Kết luận: độ tinh khiết sắc ký của các CĐC không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đánh giá. Các lọ CĐC đồng nhất về độ tinh khiết sắc ký.
3.3.6. Xác định giá trị ấn định và giá trị công bố
Giá trị ấn định và giá trị công bố được thực hiện theo hướng dẫn của ISO 13528 [73]
và tài liệu hướng dẫn thiết lập chất đối chiếu của ASEAN [44], [45].
3.3.6.1. Giá trị ấn định và giá trị công bố của CĐC Crinamidin
Từ kết quả ở Bảng 3.19, giá trị s* không thay đổi sau 3 lần tính, giá trị ấn định là 98,74% với độ lệch chuẩn thực của giá trị ấn định (s*) là 0,023.
Xác định z-score: loại bỏ 1 giá trị có /z/ > 2.
Giá trị công bố được tính từ các giá trị còn lại:
độ tinh khiết sắc ký: X = 98,74% (n = 17), RSD = 0,023%
độ khụng đảm bảo đo à = 0,007
Bảng 3.19: Kết quả phân tích robust A của CĐC crinamidin.
Chu kỳ 0 1 2 3
δ - 0,033 0,036 0,035
x*-δ - 98,70 98,70 98,70
x*+δ - 98,76 98,77 98,77
TB 98,74 98,74 98,74 98,74
SD 0,028 0,021 0,020 0,020
x* 98,73 98,74 98,74 98,74
s* 0,022 0,024 0,023 0,023
Như vậy, CĐC crinamidin có độ tinh khiết sắc ký 98,74% theo nguyên trạng.
3.3.6.2. Giá trị ấn định và giá trị công bố của CĐC 6-hydroxycrinamidin Giá trị ấn định: 96,75%; s* = 0,017.
Loại bỏ 4 giỏ trị cú /z/ > 2. Giỏ trị: X = 96,74% (n=14), RSD = 0,025%; à = 0,006.
Bảng 3.20: Kết quả phân tích robust A của CĐC 6-hydroxycrinamidin.
Chu kỳ 0 1 2 3
δ - 0,022 0,026 0,026
x*-δ - 96,73 96,72 96,72
x*+δ - 96,77 96,77 96,77
TB 96,76 96,75 96,75 96,75
SD 0,025 0,015 0,015 0,015
x* 96,75 96,75 96,74 96,75
s* 0,015 0,017 0,017 0,017
3.3.6.3. Giá trị ấn định và giá trị công bố của CĐC hippadin Giá trị ấn định: 99,99%; s* = 0,009.
Loại bỏ 1 giỏ trị cú /z/ > 2. Giỏ trị: X = 99,99% (n=17), RSD = 0,007%; à = 0,003.
Bảng 3.21: Kết quả phân tích robust A của CĐC hippadin.
Chu kỳ 0 1 2 3
δ - 0,022 0,015 0,014
x*-δ - 99,97 99,98 99,98
x*+δ - 100,01 100,01 100,01
TB 99,99 99,99 99,99 99,99
SD 0,009 0,009 0,008 0,008
x* 99,99 99,99 99,99 99,99
s* 0,015 0,010 0,009 0,009
Như vậy, CĐC hippadin có độ tinh khiết sắc ký 99,99% theo nguyên trạng.
3.3.6.4. Giá trị ấn định và giá trị công bố của CĐC lycorin Giá trị ấn định: 99,98%; s* = 0,020.
Xác định z-score, không loại bỏ giá trị nào.
Giỏ trị cụng bố X = 99,98% (n = 18), RSD = 0,017%; à = 0,006.
Bảng 3.22: Kết quả phân tích robust A của CĐC lycorin.
Chu kỳ 0 1 2 3
δ - 0,033 0,030 0,030
x*-δ - 99,95 99,95 99,95
x*+δ - 100,02 100,01 100,01
TB 99,98 99,98 99,98 99,98
SD 0,018 0,018 0,018 0,018
x* 99,99 99,98 99,98 99,98
s* 0,022 0,020 0,020 0,020
Như vậy, CĐC lycorin có độ tinh khiết sắc ký 99,98% theo nguyên trạng.
3.3.6.5. Giá trị ấn định và giá trị công bố của CĐC astragalin Giá trị ấn định: 98,28%; s* = 0,115.
Loại bỏ 3 giỏ trị cú /z/ > 2. Giỏ trị X = 98,25% (n=15), RSD = 0,084%; à = 0,037.
Bảng 3.23: Kết quả phân tích robust A của CĐC astragalin.
Chu kỳ 0 1 2 3
= 1,5s* - 0,167 0,173 0,173
x* - - 98,10 98,10 98,10
x* + - 98,43 98,45 98,45
TB 98,30 98,28 98,28 98,28
SD 0,150 0,101 0,101 0,101
x* 98,27 98,28 98,28 98,28
s* 0,111 0,115 0,115 0,115
Như vậy, CĐC astragalin có độ tinh khiết sắc ký 98,25% theo nguyên trạng.
3.3.6.6. Giá trị ấn định và giá trị công bố của chất CĐC isoquercitrin Giá trị ấn định là x* = 98,15% s* = 0,018.
Loại bỏ 6 giỏ trị cú /z/ > 2. Giỏ trị X = 98,16% (n=12), RSD = 0,012%; à = 0,005.
Bảng 3.24: Kết quả phân tích robust A của CĐC isoquercitrin.
Chu kỳ 0 1 2 3
δ - 0,022 0,012 0,012
x*-δ - 98,13 98,12 98,12
x*+δ - 98,17 98,17 98,17
TB 98,14 98,15 98,15 98,15
SD 0,034 0,016 0,016 0,016
x* 98,15 98,15 98,15 98,15
s* 0,015 0,018 0,018 0,018
Như vậy, CĐC isoquercitrin có độ tinh khiết sắc ký 98,16% theo nguyên trạng.
Bảng 3.25: Kết quả xác định giá trị ấn định và giá trị công bố các chất đối chiếu.
Tờn chất khảo sỏt x*% s* àx X%
Crinamidin 98,74 0,023 0,007 98,74
6-hydroxycrinamidin 96,75 0,017 0,006 96,74
Hippadin 99,99 0,009 0,003 99,99
Lycorin 99,98 0,020 0,006 99,98
Astragalin 98,28 0,115 0,037 98,25