CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.1. Chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid và phân đoạn flavonoid bằng phương pháp chiết ngấm kiệt
- Nguyên liệu: lá, thân hành và rễ TNHC được thu hái vào tháng 4/2010.
- Thiết bị: bình chiết ngấm kiệt kích thước (8 x 15 x 50 cm)
- Dung môi – hóa chất: cồn 50%, 70% và 96%; cloroform, ethyl acetat, dung dịch acid hydrocloric 1%, dung dịch amonoiac 25%.
Khảo sát các nồng độ cồn (50%, 70% và 96%) lên quá trình tiến hành, hiệu suất và độ tinh khiết của cao cồn, PĐ alcaloid và PĐ flavonoid.
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ khảo sát quy trình chiết hoạt chất từ cây TNHC.
- Các bước tiến hành:
Chiết cao cồn: cân 1 kg dược liệu, làm ẩm bằng dung môi chiết khoảng 12 giờ. Cho dung môi ngập dược liệu khoảng 1– 2 cm, ngâm khoảng 24 giờ. Tỷ lệ dung môi – dược liệu (10 : 1). Gộp các dịch chiết và cô cách thủy ở nhiệt độ 60 oC đến cao đặc.
Các cao cồn được ký hiệu như sau:
CL-50; 70; 96 (cao cồn chiết từ lá bằng cồn 50%; 70%; 96%).
CH-50; 70; 96 (cao cồn chiết từ thân hành bằng cồn 50%; 70%; 96%).
CR-50; 70; 96 (cao cồn chiết từ rễ bằng cồn 50%; 70%; 96%).
Chiết phân đoạn flavonoid (PĐ flavonoid): cân 100 g cao cồn, siêu âm hòa tan với dung dịch acid hydrocloric 1%, lọc lấy phần dịch. Lắc với dung môi ethyl acetat (3 lần, lần thứ nhất với 500 ml dung môi, 250 ml cho lần thứ hai và ba). Gộp các dịch chiết ethyl acetat, thu hồi dung môi.
Các phân đoạn flavonoid này được ký hiệu như sau:
FL-50; 70; 96 (PĐ flavonoid chiết từ lá với cồn 50%; 70%; 96%).
FH-50; 70; 96 (PĐ flavonoid chiết từ thân hành với cồn 50%; 70%; 96%).
FR-50; 70; 96 (PĐ flavonoid chiết từ rễ với cồn 50%; 70%; 96%).
Chiết phân đoạn alcaloid (PĐ alcaloid): lớp dịch acid sau khi chiết flavonoid được kiềm hóa bằng amoniac 25% đến pH 9 – 10. Lắc với dung môi cloroform (3 lần, lần thứ nhất với 500 ml dung môi, 250 ml cho lần thứ hai và ba). Gộp các dịch chiết cloroform, thu hồi dung môi.
Các phân đoạn alcaloid này được ký hiệu như sau:
AL-50; 70; 96 (PĐ alcaloid chiết từ lá với cồn 50%; 70%; 96%).
AH-50; 70; 96 (PĐ cao alcaloid chiết từ thân hành cồn 50%; 70%; 96%).
AR-50; 70; 96 (PĐ cao alcaloid chiết từ rễ với cồn 50%; 70%; 96%).
Nhận xét quá trình chiết (thời gian, tạp đi kèm), hiệu suất, thành phần của sản phẩm chiết để xác định dung môi chiết cho hiệu suất cao và sản phẩm ít tạp nhất.
2.3.1.2. Chiết PĐ alcaloid và PĐ flavonoid bằng phương pháp SFE - Nguyên liệu: bột lá TNHC được thu hái vào tháng 4/2012.
- Dung môi – hóa chất: cồn 96%; cồn 70%, dung môi CO2 lỏng siêu tới hạn, cloroform, ethyl acetat, dung dịch acid hydrocloric 1%, dung dịch amonoiac 25%.
Hoạt chất được chiết qua 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: chiết PĐ alcaloid và PĐ flavonoid bằng phương pháp SFE
- Thiết bị: là hệ thống chiết bằng dung môi CO2 siêu tới hạn TST (do Đài loan sản xuất) với ba bình chiết lắp song song có thể tích 20 lít/bình.
Tất cả các thí nghiệm đều thực hiện ở nhiệt độ 50 oC. Khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của các yếu tố thời gian, dung môi, áp suất lên thành phần và hiệu suất chiết như sau:
- Cố định thời gian chiết là 120 phút và áp suất là 250 bar, khảo sát ảnh hưởng của hai loại dung môi chiết là CO2 và CO2 + 15% cồn 96%.
- Tiếp tục khảo sát yếu tố thời gian chiết ở 120, 180, 240 phút.
- Từ điều kiện thời gian và dung môi chiết, khảo sát ảnh hưởng của các áp suất 150, 200 và 250 bar.
- Sau khi khảo sát, chọn các điều kiện thích hợp nhất để áp dụng chiết PĐ alcaloid và PĐ flavonoid trên mẫu bột lá TNHC.
- Dịch chiết SFE được thu hồi dung môi đến cao đặc, ký hiệu là cao L-SFE.
Cao L-SFE được hòa tan với dung dịch acid hydrocloric 1%. Lọc lấy dịch acid. Dịch lọc được lắc với ethyl acetat đến khi không còn phản ứng với TT FeCl3 1%. Thu hồi dung môi, được PĐ flavonoid, ký hiệu FL-SFE.
- Dịch acid sau khi chiết flavonoid được kiềm hóa với dung dịch amoniac 25%
đến pH 9 – 10, lắc với cloroform đến khi không còn phản ứng với TT Dragendorff.
Thu hồi dung môi, được PĐ alcaloid, ký hiệu AL-SFE.
Giai đoạn 2: chiết alcaloid và flavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt - Thiết bị: bình chiết ngấm kiệt, kích thước (30 x 50 x 180 cm)
- Bột lá sau khi chiết SFE thì được sử dụng để tiếp tục chiết alcaloid và flavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi cồn 70%.
Sơ đồ 2.2 Chiết hoạt chất từ lá TNHC kết hợp 2 phương pháp SFE và ngấm kiệt.
2.3.2. Phân lập hợp chất tinh khiết
Lựa chọn các PĐ alcaloid và flavonoid ít tạp và có cắn ngay trong phân đoạn ban đầu để phân lập các hợp chất tinh khiết. Các giai đoạn phân lập chính bao gồm: tách phân đoạn nhỏ (có thành phần đơn giản hơn) bằng SKC chân không (VLC), phân lập chất tinh khiết bằng SKC cổ điển hoặc kết tinh lại trong dung môi tinh khiết.
2.3.2.1. Sắc ký cột chân không
Mục đích: tách PĐ ban đầu thành những phân đoạn có thành phần đơn giản hơn.
Tiến hành: nạp chất hấp phụ vào cột và ổn định cột bằng n–hexan, nạp mẫu theo phương pháp nhồi cột khô. Rửa giải lần lượt với dung môi hoặc hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Bắt đầu với n–hexan, diethyl ether, cloroform, ethyl acetat rồi đến methanol. Mỗi ống hứng 500 ml dung môi. Các ống hứng được kiểm tra bằng SKLM, gộp chung các ống có thành phần tương tự nhau thành các phân đoạn nhỏ tương ứng.
2.3.2.2. Sắc ký cột cổ điển
Mục đích: phân lập các hợp chất tinh khiết từ các phân đoạn sau khi VLC.
Tiến hành: nạp chất hấp phụ, ổn định cột bằng n–hexan, nạp mẫu theo phương pháp nhồi cột khô, thể tích mỗi ống hứng khoảng 10 – 15 (ml). Tùy vào độ phân cực của mẫu, dung môi bắt đầu có thể là n–hexan, hoặc diethyl ether, hoặc cloroform hoặc hỗn hợp cỏc dung mụi. Chất hấp phụ là silica gel cỡ hạt 15 – 40 (àm) hoặc 40 – 63 (àm) được ỏo bờn ngoài bằng hệ đệm cú pH 9 – 10 để phõn lập alcaloid; pH 3 – 4 để phân lập flavonoid. Hoặc chất hấp phụ pha đảo silica gel RP-18 cũng được sử dụng tùy tính chất của mẫu.
Yêu cầu: chất phân lập phải tinh khiết (≥ 95%), kiểm tra bằng SKLM hoặc HPLC.
2.3.2.3. Xác định cấu trúc hóa học
Cấu trúc các hợp chất sau khi phân lập được định xác định bằng phổ hồng ngoại (IR), tử ngoại – khả kiến (UV-Vis), khối lượng (MS) và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
2.3.3. Thiết lập chất đối chiếu
- Lựa chọn các alcaloid và flavonoid đã xác định cấu trúc, có khối lượng trên 500 mg với độ tinh khiết trên 95% (HPLC), quy trình phân lập ổn định để thiết CĐC.
Các bước thực hiện theo hướng dẫn của tài liệu do ASEAN [44], [45] ấn bản về quy trình thiết lập CĐC. Các bước tiến hành như sau:
2.3.3.1. Xây dựng phương pháp đánh giá nguyên liệu thiết lập CĐC
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM): khảo sát trên 3 hệ dung môi khác nhau để đánh giá độ tinh khiết dựa vào vết chính duy nhất hoặc một vết chính và vết tạp.
- Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (TGA): xác định độ tinh khiết và hàm ẩm.
Gia nhiệt tốc độ 1 oC/phút đến qua khỏi nhiệt độ nóng chảy của mẫu khoảng 50 oC, lưu lượng dòng khí nitơ 50,0 ml/phút. Mỗi mẫu xác định 3 lần.
Độ tinh khiết của mẫu thử được xác định trên kết quả trung bình.
- Phương pháp HPLC: mỗi CĐC được xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký với các điều kiện phân tích tương ứng với từng mẫu. Quy trình được khảo sát tính
phù hợp của hệ thống và được thẩm định theo đúng yêu cầu của quy trình phân tích định lượng bằng HPLC [68].
2.3.3.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đánh giá nguyên liệu thiết lập CĐC Các chỉ tiêu và phương pháp thử được xây dựng bao gồm: tính chất, định tính (phổ IR, HPLC), điểm chảy, định lượng (độ tinh khiết sắc ký).
2.3.3.3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đánh giá CĐC
Chất đối chiếu đạt yêu cầu như CĐC hóa học thứ cấp dùng cho phép thử định lượng.
Các chỉ tiêu và phương pháp thử bao gồm: tính chất, định tính (phổ IR, HPLC), định lượng (độ tinh khiết sắc ký).
2.3.3.4. Đóng gói và đánh giá đồng nhất lô
Đóng gói: CĐC được đóng trong lọ thủy tinh nâu, khối lượng đóng mỗi lọ là 5 mg và thực hiện trong Glove-box (khí nitơ 99,99%, độ ẩm tương đối 40%).
Đánh giá đồng nhất lô: tổng số lọ đóng được của mỗi chất là N = 100 lọ. Mỗi mẫu đánh giá trên 11 lọ. Mỗi lọ phân tích hai lần, lấy kết quả trung bình.
Phân tích bằng thống kê ANOVA một yếu tố để đánh giá tính đồng nhất lô.
2.3.3.5. Đánh giá độ đồng nhất liên phòng thí nghiệm
- Sau khi lô CĐC đạt yêu cầu về tính đồng nhất, chất đối chiếu được tiếp tục đánh giá đồng nhất tại ba phòng thí nghiệm (PTN) đạt GLP hoặc ISO 17025.
- Mỗi PTN nhận 6 lọ CĐC được lấy ngẫu nhiên cùng bộ hồ sơ (các dữ liệu phổ học, quy trình phân tích) để tiến hành phân tích. Mỗi lọ CĐC được phân tích hai lần trên cùng quy trình, lấy kết quả trung bình.
2.3.3.6. Xác định giá trị ấn định – Giá trị công bố
- Giá trị ấn định: được xác định từ 18 kết quả của ba PTN tham gia đánh giá.
Xử lý thống kê theo hướng dẫn của ISO 13528 [73], các bước tiến hành như sau:
- Sắp xếp kết quả định lượng theo thứ tự tăng dần: x1, x2,..., xn.
- Gọi giá trị trung bình (robust average) và độ lệch chuẩn (robust standard deviation) của các kết quả này lần lượt là x*và s*. Tính giá trị khởi điểm của x*và s*.
- Chu kỳ tính các giá trị mới của x*và s* được tính lặp lại đến khi các giá trị này không đổi ở số thứ ba sau dấu phẩy. Chọn x*và s*cuối cùng là giá trị ấn định và độ lệch chuẩn của giá trị ấn định.
- Độ khụng đảm bảo đo àx của giỏ trị ấn định được tớnh theo:
n s
x
*
25 ,
1
- Giá trị công bố: được tính trên các số liệu sau khi loại các giá trị có z2. 2.3.4. Phương pháp định tính, định lượng alcaloid và flavonoid 2.3.4.1. Các dung dịch thử nghiệm
Mẫu đối chiếu: - Sáu alcaloid đối chiếu gồm: crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, 6-hydroxypowellin, 6-hydroxybuphanidrin, undulatin, 6-hydroxyundulatin.
- Hai flavonoid đối chiếu là astragalin và isoquercitrin.
Mẫu thử: mẫu AL-SA hoặc FL-SA được chiết từ bột lá TNHC theo Sơ đồ 3.6.
Nồng độ CĐC được pha tương ứng với nồng độ định lượng của mẫu thử.
Dung môi hòa tan mẫu đối chiếu và mẫu thử được lựa chọn theo kết quả khảo sát.
2.3.4.2. Định tính, định lượng alcaloid hoặc flavonoid trong lá TNHC bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Thiết bị: hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Alliance 2695-2996, cột sắc ký C8
Phenomenex (250 x 4,6 mm; 5 m), đầu dò PDA.
Tiến hành: khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến độ hòa tan của mẫu thử và sự tách trên SKĐ như sau:
- Phương pháp xử lý mẫu: mẫu AL-SA hoặc FL-SA được hòa tan ở nồng độ thích hợp rồi tiêm trực tiếp hoặc loại tạp bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) trước khi tiêm vào hệ thống. Quan sát SKĐ của hai trường hợp trên và chọn trường hợp mẫu thử cho SKĐ có độ phân giải (Rs) đạt yêu cầu, ít pic tạp nhưng đảm bảo tỷ lệ phục hồi của các chất tan.
- Thành phần và pH của pha động: khảo sát trên hai dung môi là methanol và acetonitril, phối hợp với dung dịch có pH thay đổi (dung dịch đệm hoặc dung dịch acid) ở các tỷ lệ sao cho sự tách và độ cân đối của pic đạt yêu cầu.
- Kỹ thuật rửa giải: sau khi lựa chọn được các điều kiện sắc ký cho SKĐ đạt yêu cầu về độ phân giải, tiến hành khảo sát thêm hai kỹ thuật rửa giải đẳng dòng (isocratic) và chương trình dung môi (gradient) để chọn điều kiện sắc ký cho thời gian phân tích phù hợp nhất với từng mẫu alcaloid hoặc flavonoid.
2.3.4.3. Định tính, định lượng alcaloid hoặc flavonoid trong lá TNHC bằng phương pháp điện di mao quản (CE)
Thiết bị: hệ thống điện di Agilent G7100A; đầu dò PDA; cột mao quản silica nung chảy chiều dài tổng 64,5 cm; chiều dài hiệu quả 56 cm; đường kính trong 50 μm.
Tiến hành: khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến độ hòa tan của mẫu, quá trình điện di để đạt được hiệu năng tách hiệu quả nhất.
Các yếu tố được khảo sát như sau:
- Phương pháp xử lý mẫu: một số dung môi khảo sát gồm methanol, dung dịch acid hoặc hòa tan trong dung dịch đệm là thành phần dung dịch điện di nền. Tương tự phương pháp HPLC, quan sát và chọn điều kiện cho điện di đồ có Rs đạt yêu cầu, ít pic tạp nhưng đảm bảo tỷ lệ phục hồi của các chất tan.
- Hệ đệm và nồng độ dung dịch đệm: thực hiện các thử nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các hệ đệm lên quá trình điện di như đệm borat, phosphat và đệm amoni clorid.
- pH của dung dịch đệm: sau khi chọn được hệ đệm, khảo sát một vài dung dịch đệm có pH thay đổi. Chọn dung dịch đệm có pH đáp ứng khả năng đệm và cho sự tách hiệu quả nhất trên điện di đồ.
- Kỹ thuật điện di: khảo sát hai kỹ thuật điện di mao quản vùng (CZE) và sắc ký điện di (MEKC) để chọn kỹ thuật phù hợp với từng mẫu thử.
Các mẫu thử phù hợp với kỹ thuật MEKC thì cần khảo sát thêm nồng độ chất diện hoạt sodium dodecyl sulfat (SDS).
- Khảo sát ảnh hưởng của dung môi hữu cơ: thay đổi nồng độ methanol hay acetonitril thêm vào dung dịch điện di nền để tăng thêm hiệu lực tách, tăng khả năng hòa tan và cải thiện hệ số bất đối của các pic trên đện di đồ.
Yêu cầu: sau các thử nghiệm khảo sát, chọn điều kiện sắc ký hoặc điện di để khi phân tích cho SKĐ hoặc điện di đồ đạt yêu cầu về độ phân giải giữa các pic cần định lượng có Rs ≥ 1,5; hệ số bất đối As của từng pic nằm trong giới hạn 0,8 ≤ As ≤ 1,5);
các hệ số sắc ký về thời gian lưu Rt và diện tích pic S (tỷ số diện tích pic chuẩn hóa) không dao động lớn giữa các lần phân tích (RSD ≤ 2%).
Áp dụng điều kiện sắc ký (điện di) đã chọn vào khảo sát tính phù hợp của hệ thống và tiến hành thẩm định phương pháp phân tích.
2.3.4.4. Khảo sát tính phù hợp của hệ thống của các quy trình phân tích:
Tiến hành: tiêm 6 lần liên tiếp mẫu đối chiếu có cùng nồng độ, cùng điều kiện.
Yêu cầu: RSD% của thời gian lưu hoặc thời gian di chuyển; diện tích hoặc tỷ số diện tích pic chuẩn hóa của các pic cần định lượng phải ≤ 2%; hệ số AF từ 0,8 ≤ AF ≤ 1,5 và độ phân giải giữa các pic cần định lượng Rs ≥ 1,5 [3], [10].
2.3.4.5. Thẩm định quy trình phân tích HPLC và CE [10], [67],[68]
a. Tính đặc hiệu: tiến hành sắc ký hoặc điện di mẫu trắng, mẫu đối chiếu, mẫu thử và mẫu thử thêm chất đối chiếu.
Yêu cầu:
- Sắc ký đồ hoặc điện di đồ mẫu trắng không có các tín hiệu tại thời gian lưu của các pic cần định lượng trong sắc ký đồ hoặc điện di đồ của mẫu đối chiếu.
- Sắc ký đồ hoặc điện di đồ của mẫu thử có các pic có thời gian lưu tương ứng với sắc ký đồ hoặc điện di đồ của mẫu đối chiếu.
- Độ tinh khiết pic của các pic cần định lượng trong mẫu thử phải đạt theo cách xác định độ tinh khiết pic tính từ phần mềm của hệ thống.
- Khi thêm một lượng chất đối chiếu vào mẫu thử thì có sự tăng về diện tích pic hoặc tỷ số diện tích pic được chuẩn hóa so với mẫu thử ban đầu. Hoặc sự tăng
b. Tính tuyến tính: pha 6 dung dịch đối chiếu có nồng độ tăng dần trong khoảng 80 đến 120% so với nồng độ trong mẫu thử. Tiến hành sắc ký hoặc điện di theo điều kiện đã chọn.
Kết quả được đánh giá bằng cách tính đường hồi qui dựa vào phương pháp bình phương tối thiểu, phương trình Y= ax + b.
Yêu cầu: có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic (hoặc tỷ số diện tích pic chuẩn hóa) với nồng độ chất đối chiếu ở khoảng nồng độ khảo sát, hệ số R2 ≥ 0,998.
c. Độ chính xác:
- Độ lặp lại: thực hiện định lượng trên 6 mẫu thử khác nhau ở nồng độ 100% chất cần phân tích có trong mẫu thử. Mỗi mẫu định lượng 2 lần, lấy kết quả trung bình.
- Độ chính xác trung gian: được thực hiện định lượng trên 6 mẫu thử khác nhau và thực hiện ở các ngày khác nhau. Mỗi mẫu định lượng 2 lần, lấy kết quả trung bình.
Yêu cầu: RSD% giữa các kết quả định lượng phải ≤ 5,3% [67].
d. Độ đúng: thêm vào mẫu thử một lượng chất đối chiếu tương ứng với 10%, 20%
và 30% của nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu thử. Tiến hành định lượng 3 nồng độ, mỗi nồng độ thực hiện trên 3 mẫu.
Độ đúng là tỷ lệ phục hồi % giữa nồng độ chất đối chiếu tìm thấy so với lượng chất đối chiếu thêm vào.
Yêu cầu: tỷ lệ phục hồi trong khoảng 90 – 107% [67].
e. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Hai giới hạn này được tính trên độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc theo các công thứ tương ứng như sau:
- Giới hạn phát hiện:
a LOD3,3SD
- Giới hạn định lượng:
a LOQ10SD
trong đó a là độ dốc của đường chuẩn và SD là độ lệch chuẩn của đáp ứng.