CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.4. Xây dựng phương pháp HPLC, CE, dấu vân tay để định tính và định lượng
3.4.1. Quy trình xử lý mẫu
- Nguyên liệu: lá TNHC được thu hái vào tháng 5/2012, độ ẩm 12%.
- Thiết bị: bể siêu âm gia nhiệt Elma S-15.
- Quy trình: chiết alcaloid, flavonoid được chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm:
Mẫu alcaloid: cân 10 g bột lá, thêm 50 ml cồn 70%, siêu âm khoảng 30 phút ở nhiệt độ 50 ± 2 oC (x 3 lần), tần số 37 kHz. Dịch chiết được thu hồi dung môi, kiềm hóa bằng dung dịch amoniac 25% đến pH 9 – 10. Chiết với 30 ml cloroform (x 3 lần).
Gộp toàn bộ dịch cloroform, thu hồi dung môi đến cắn, được mẫu alcaloid AL-SA.
Mẫu flavonoid: cân 10 g bột lá, thêm 50 ml ethanol 70%, siêu âm khoảng 30 phút ở nhiệt độ 50 ± 2 oC (x 3 lần), tần số 37 kHz. Dịch chiết được thu hồi dung môi, acid hóa bằng acid hydrocloric 1% đến pH 3 – 4. Chiết với 30 ml ethyl acetat (x 3 lần). Gộp dịch ethyl acetat, thu hồi dung môi đến cắn, được mẫu flavonoid FL-SA.
- Sơ đồ chiết:
Sơ đồ 3.5 Sơ đồ chiết alcaloid AL-SA hoặc flavonoid FL-SA.
3.4.2. Quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid bằng phương pháp HPLC 3.4.2.1. Pha dung dịch thử nghiệm:
Dung dịch thử: mẫu AL-SA được hòa tan và điền đầy bằng pha động trong bình định mức 10 ml. Lọc qua màng lọc 0,45 àm. Dịch lọc được tiờm vào hệ thống HPLC.
Dung dịch đối chiếu: các alcaloid đối chiếu được pha trong pha động.
3.4.2.2. Điều kiện sắc ký: sau các thử nghiệm khảo sát, điều kiện sắc ký như sau - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Nhiệt độ cột: 40 oC
- Thể tớch tiờm: 10 àl - Bước súng phỏt hiện: 214 nm Rửa giải gradient dung môi ở Bảng 2.26, với pha động là hỗn hợp methanol (dung môi A); dung dịch acid phosphoric pH 3 và 0,2% TEA (dung môi B).
Bảng 3.26: Chương trình dung môi định lượng 6 alcaloid bằng HPLC.
Thời gian (phút) % dung môi A % dung môi B
0 20 80
12 20 80
13 25 75
25 25 75
26 20 80
30 20 80
3.4.2.3. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống:
Nhận xét: RSD% thời gian lưu và diện tích của các pic đều < 2%; độ phân giải >1,5;
hệ số bất đối trong khoảng 0,8 – 1,5. Như vậy, quy trình đạt tính phù hợp hệ thống.
Bảng 3.27: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6).
Thông số (1)* (2) * (3) * (4) * (5) * (6) *
TR
TB 9,16 10,83 13,69 18,16 20,85 23,60
RSD (%) 0,67 0,22 0,58 0,67 0,65 0,71
S TB 14638076 25642987 15678220 19516292 17786542 10127920
RSD (%) 0,23 0,22 0,26 0,75 0,25 0,42
Rs TB 4,5 4,5 6,1 10,6 5,8 5,3
As TB 1,4 1,4 1,4 1,0 1,5 -
(1)*: 6-hydroxycrinamidin (2)*: 6-hydroxypowellin (3)*: crinamidin (4)*: 6-hydroxybuphanidrin (5)*: 6-hydroxyundulatin (6)*: undulatin TR: thời gian lưu (phỳt) As: hệ số bất đối S: diện tớch pic (àV x giõy)
3.4.2.4. Kết quả thẩm định quy trình
- Tính đặc hiệu: tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu đối chiếu, mẫu thử và mẫu thử thêm chất đối chiếu. Các SKĐ như Hình 3.13.
Như vậy, quy trình đáp ứng các yêu cầu về tính đặc hiệu của một quy trình định lượng.
Hình 3.13.A SKĐ mẫu trắng.
Hình 3.13.B. SKĐ và độ tinh khiết pic của 6 alcaloid đối chiếu.
Hình 3.13.C: SKĐ mẫu alcaloid AL-SA chiết từ lá TNHC.
Hình 3.13.D: Độ tinh khiết của 6 pic alcaloid trong mẫu AL-SA chiết từ lá TNHC.
Hình 3.13: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu trong quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC.
- Tính tuyến tính: pha 6 dung dịch đối chiếu có nồng độ 10; 20; 50; 100; 250 và 500 (àg/ml), tiến hành sắc ký theo điều kiện đó chọn mỗi nồng độ thực hiện 2 lần.
Nhận xét: có sự tương quan giữa nồng độ và diện tích pic trong khoảng nồng độ khảo sát, giá trị của hệ số R2 > 0,998.
Phương trình hồi qui của các alcaloid trong quy trình định lượng bằng HPLC:
6-hydroxycrinamidin: Y = 149967x R2 = 0,9996 6-hydroxypowellin: Y = 38956x R2 = 0,9992 Crinamidin: Y = 70299x R2 = 0,9994 6-hydroxyundulatin: Y = 60708x R2 = 0,9999 6-hydroxybuphanidrin: Y = 28591x R2 = 0,9999 Undulatin: Y = 73220x R2 = 0,9991
- Độ chính xác: tiến hành sắc ký 6 mẫu thử ở 100% nồng độ định lượng, thực hiện trong ngày và 6 mẫu thử thực hiện ở 6 ngày khác nhau. Kết quả trình bày ở Bảng 3.28, tất cả các pic cần định lượng đều có RSD% của kết quả định lượng ≤ 5,3%.
Bảng 3.28: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trong quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6).
Tờn alcaloid Hàm lượng alcaloid trong lỏ TNHC (àg/g) Độ lặp lại Độ chính xác trung gian
Crinamidin à = 143,3 ± 3,3
(RSD = 2,18%)
à = 145,3 ± 3,3 (RSD = 2,16%) 6-hydroxycrinamidin à = 109,7 ± 3,1
(RSD = 1,73%)
à = 112,1 ± 3,2 (RSD = 2,68%) 6-hydroxypowellin à = 337,8 ± 7,8
(RSD = 2,21%)
à = 345,9 ± 9,5 (RSD = 2,63%) 6-hydroxybuphanidrin à = 416,1 ± 9,1
(RSD = 2,01%)
à = 421,1 ± 9,9 (RSD = 2,24%)
Undulatin à = 76,5 ± 2,2
(RSD = 2,18%)
à = 77,6 ± 2,6 (RSD = 3,17%) 6-hydroxyundulatin à = 281,6 ± 8,1
(RSD = 2,74%)
à = 286,4 ± 7,1 (RSD = 2,35%) Nhận xét: quy trình đạt độ chính xác.
- Độ đúng: thực hiện phương pháp thêm chuẩn, cho vào mẫu thử một lượng chất đối chiếu tương ứng ở 3 nồng độ 10; 20 và 30 % so với nồng độ định lượng.
Tiến hành sắc ký mỗi nồng độ 3 lần.
Kết quả được trình bày ở Bảng 3.29, tất cả các pic cần định lượng đều có tỷ lệ phục hồi trong giới hạn từ 90 – 107%.
Bảng 3.29: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9).
Tên alcaloid Tỷ lệ phục hồi
10% 20% 30% TB%
Crinamidin 98,28 97,98 98,16 98,1
6-hydroxycrinamidin 102,48 100,56 102,16 101,7 6-hydroxypowellin 98,15 97,78 98,27 98,0 6-hydroxybuphanidrin 103,06 102,22 103,08 102,8
Undulatin 102,23 102,21 102,15 102,2
6-hydroxyundulatin 102,12 101,88 103,08 102,4 Nhận xét: quy trình đạt yêu cầu về độ chính xác và độ đúng.
- Giới hạn phỏt hiện LOD (àg/ml) và giới hạn định lượng LOQ (àg/ml):
LOD (àg/ml) LOQ (àg/ml)
Crinamidin 0,28 0,84
6-hydroxycrinamidin 0,15 0,45
6-hydroxypowellin 0,61 1,84
6-hydroxybuphanidrin 0,25 0,76
Undulatin 0,31 0,94
6-hydroxyundulatin 0,75 2,27
3.4.3. Quy trình định lượng đồng thời 2 flavonoid bằng HPLC 3.4.3.1. Pha dung dịch thử nghiệm:
Dung dịch thử: mẫu FL-SA được hòa tan và điền đầy bằng pha động trong bình định mức 10 ml. Lọc qua màng lọc 0,45 àm. Dịch lọc được tiờm vào hệ thống HPLC.
Dung dịch đối chiếu: hũa tan astragalin (250 àg/ml) và isoquercitrin (100 àg/ml) bằng pha động, lọc qua màng lọc 0,45 àm.
3.4.3.2. Điều kiện sắc ký: sau các thử nghiệm khảo sát, điều kiện sắc ký như sau - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Nhiệt độ cột: 40 oC
- Thể tớch tiờm: 10 àl - Bước súng phỏt hiện: 265 nm - Cột HPLC Phenomenex C8 (250 x 4,6 mm; 5 àm).
- Pha động: acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH 4 (20 : 80) 3.4.3.3. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống:
Bảng 3.30: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình đinh lượng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6).
TR
(phút)
Diện tích pic (àV x giõy)
Hệ số bất đối (0,8 ≤ As ≤1,5)
Độ phân giải (Rs ≥ 1,5) Isoquercitrin 11,9
RSD% = 0,94
3381504
RSD% = 1,52 1,1 13,5
Astragalin 18,2 RSD% = 0,84
8045980
RSD% = 1,02 1,1 13,5
Kết quả: RSD% của thời gian lưu và diện tích của các pic < 2%, độ phân giải >1,5;
hệ số bất đối trong khoảng 0,8 – 1,5. Như vậy, quy trình đạt tính phù hợp hệ thống.
3.4.3.4. Thẩm định quy trình
- Tính đặc hiệu: tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu đối chiếu, mẫu thử và mẫu thử thêm chất đối chiếu. Các SKĐ như Hình 3.14, quy trình đáp ứng các yêu cầu về tính đặc hiệu của một quy trình định lượng. Như vậy, quy trình đạt tính đặc hiệu.
Hình 3.14.A Sắc ký đồ mẫu trắng
Hình 3.14.B: SKĐ mẫu đối chiếu astragalin và isoquercitrin.
Hình 3.14.C: SKĐ mẫu thử định lượng astragalin và isoquercitrin.
Hình 3.14: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu trong quy trình định lượng đồng thời
- Tính tuyến tính: pha 6 dung dịch đối chiếu nồng độ 10; 20; 50; 100; 250 và 500 (àg/ml), tiến hành sắc ký theo điều kiện đó chọn. Mỗi nồng độ thực hiện 2 lần.
Phương trình hồi qui: Astragalin Y = 32797x; R2 = 0,9999 Isoquercitrin Y = 34939x; R2 = 0,9999
Nhận xét: có sự tương quan giữa nồng độ và diện tích pic trong khoảng khảo sát, giá trị của hệ số R2 > 0,998.
- Độ chính xác: tiến hành sắc ký 6 mẫu thử ở 100% nồng độ định lượng, thực hiện trong ngày và 6 mẫu thử thực hiện ở 6 ngày khác nhau. Pic astragalin và isoquercitrin đều có RSD% của kết quả định lượng ≤ 5,3% (Bảng 3.31).
Bảng 3.31: Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định lượng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng HPLC (n = 6).
Tờn flavonoid Hàm lượng flavonoid trong lỏ TNHC (àg/g) Độ lặp lại Độ chính xác trung gian
Isoquercitrin à = 127,0 ± 2,5 (RSD = 1,72%)
à = 125,9 ± 2,6 (RSD = 1,99%)
Astragalin à = 269,1 ± 4,5
(RSD = 1,60%)
à = 266,0 ± 6,2 (RSD = 2,21%)
- Độ đúng: thực hiện phương pháp thêm chuẩn, cho vào mẫu thử một lượng chất đối chiếu tương ứng ở 3 nồng độ 10; 20 và 30 % so với nồng độ định lượng. Tiến hành sắc ký mỗi nồng độ 3 lần. Các pic có tỷ lệ phục hồi từ 90 – 107% (Bảng 3.32).
Bảng 3.32: Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9).
Tên flavonoid Tỷ lệ phục hồi
10% 20% 30% TB%
Isoquercitrin 102,39 103,85 104,50 103,58 (RSD = 1,23) Astragalin 98,05 102,77 98,87 99,89 (RSD = 2,29) Nhận xét: quy trình đạt yêu cầu về độ chính xác và độ đúng.
- Giới hạn phỏt hiện LOD (àg/ml) và giới hạn định lượng LOQ (àg/ml):
LOD (àg/ml) LOQ (àg/ml)
Isoquercitrin 0,21 0,642
Astragalin 0,13 0,39
3.4.4. Quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid bằng phương pháp CE 3.4.4.1. Pha dung dịch thử nghiệm:
Pha dung dịch thử: mẫu AL-SA được hòa tan và điền đầy bằng dung dịch acid phosphoric 1% trong bỡnh định mức 10 ml. Lọc qua màng lọc 0,22 àm.
Pha dung dịch đối chiếu: các chất đối chiếu được hòa tan bằng dung dịch acid phosphoric 1%. Lọc qua màng lọc 0,22 àm.
3.4.4.2. Điều kiện điện di:
Sau các thử nghiệm khảo sát, các điều kiện điện di được chọn như sau:
- Điện thế: 25 kV - Nhiệt độ cột: 25 oC
- Kỹ thuật điện di: MEKC - Bước sóng phát hiện: 214 nm
- Cột mao quản silica nung chảy (64,5 cm; 56 cm; chiều dài hiệu quả cm; 50 μm).
- Dung dịch điện di: dinatri tetraborat 25 mM; SDS 50 mM; điều chỉnh pH 9,5 bằng dung dịch natri hydroxid 1N, phối hợp để được dung dịch điện di có 10% methanol.
3.4.4.3. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống:
Bảng 3.33: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE.
Thông số (1)* (2) * (3) * (4) * (5) * (6) * TM
TB 14,3 15,9 19,8 21,7 23,5 28,2
RSD% 0,73 0,93 0,64 0,98 0,99 1,42
CorrAT/CorrAIS
TB 0,448 3,939 2,447 4,49 0,632 0,454
RSD% 1,57 1,64 1,54 1,90 1,86 1,90
As TB 1,1 1,1 1,2 1,2 1,1 1,2
Rs TB 62,9 11,2 19,1 7,2 6,0 15,1
(1)*: 6-hydroxycrinamidin (2)*:6-hydroxyundulatin (3)*:6-hydroxypowellin (4)*: 6-hydroxybuphanidrin (5)*: crinamidin (6)*: undulatin
TR: thời gian di chuyển (phút)
CorrAT/CorrAIS: tỷ số diện tích pic chuẩn hóa của pic đối chiếu so với pic chuẩn nội Kết quả: RSD% của thời gian di chuyển và tỷ số diện tích pic chuẩn hóa các pic trong mẫu đối chiếu < 2%, độ phân giải >1,5; hệ số bất đối trong khoảng 0,8 – 1,5.
3.4.4.4. Kết quả thẩm định quy trình
- Tính đặc hiệu: các điện di đồ như Hình 3.15, quy trình đáp ứng các yêu cầu về tính đặc hiệu của quy trình định lượng. Như vậy, quy trình đạt tính đặc hiệu.
Hình 3.15.A: Điện di đồ 6 alcaloid đối chiếu.
Hình 3.15.B: Điện di đồ mẫu thử định lượng 6 alcaloid trong lá TNHC.
Hình 3.15: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE.
- Tính tuyến tính: pha 6 dung dịch đối chiếu nồng độ từ 10; 20; 50; 100; 250 và 500 (àg/ml), tiến hành điện di theo cỏc điều kiện đó chọn.
Phương trình hồi qui của các alcaloid, quy trình định lượng bằng phương pháp CE:
6-hydroxycrinamidin: Y = 4,6611x R2 = 0,9995 6-hydroxyundulatin: Y = 16,0600x R2 = 0,9992 6-hydroxypowellin: Y = 8,7405x R2 = 0,9997 6-hydroxybuphanidrin: Y = 12,6260x R2 = 0,9998 Crinamidin: Y = 5,1780x R2 = 0,9999 Undulatin: Y = 7,3694x R2 = 0,9999
Nhận xét: có sự tương quan giữa nồng độ và tỷ số diện tích pic chẩun hóa trong khoảng khảo sát, các giá trị của hệ số tương quan R2 > 0,998.
- Độ chính xác: kết quả được trình bày ở Bảng 3.34, tất cả các pic đều có RSD% của kết quả định lượng ≤ 5,3%.
Bảng 3.34: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trong quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 6).
Tờn alcaloid Hàm lượng alcaloid trong lỏ TNHC (àg/g) Độ lặp lại Độ chính xác trung gian
Crinamidin à = 145,8 ± 4,6
RSD = 3,91%
à = 142,7 ± 4,7 (RSD = 4,07%) 6-hydroxycrinamidin à = 113,4 ± 4,2
RSD = 4,64%
à = 115,4 ± 4,4 (RSD = 4,76%) 6-hydroxypowellin à = 338,9 ± 13,7
RSD = 5,06%
à = 339,7 ± 13,1 (RSD = 4,81%) 6-hydroxybuphanidrin à = 412,6 ± 14,9
RSD = 4,53%
à = 420,7 ± 14,8 (RSD = 4,38%)
Undulatin à = 75,2 ± 2,3
RSD = 3,82%
à = 75,7 ± 2,36 (RSD = 3,90%) 6-hydroxyundulatin à = 288,4 ± 7,9
RSD = 3,41%
à = 285,3 ± 8,5 (RSD = 3,71%)
- Độ đúng: kết quả được trình bày ở Bảng 3.35, tất cả các pic alcaloid cần định lượng đều có tỷ lệ phục hồi trong giới hạn từ 90 – 107%.
Bảng 3.35: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 9).
Tên alcaloid Tỷ lệ phục hồi %
10% 20% 30% TB%
6-hydroxycrinamidin 98,35 98,26 97,89 98,16 6-hydroxyundulatin 101,15 101,35 102,28 101,59 6-hydroxypowellin 99,18 98,89 99,25 99,10 6-hydroxybuphanidrin 98,43 98,78 99,45 98,87
Crinamidin 101,15 100,98 101,25 101,12
Undulatin 102,36 102,98 103,18 102,84
Nhận xét: quy trình đạt yêu cầu về độ chính xác và độ đúng.
- Giới hạn phỏt hiện LOD (àg/ml) và giới hạn định lượng LOQ (àg/ml):
LOD (àg/ml) LOQ (àg/ml)
Crinamidin 0,31 0,94
6-hydroxycrinamidin 0,24 0,73
6-hydroxypowellin 0,73 2,21
6-hydroxybuphanidrin 0,29 0,88
Undulatin 0,38 1,15
6-hydroxyundulatin 0,82 2,48
3.4.5. Quy trình định lượng đồng thời 2 flavonoid bằng phương pháp CE 3.4.5.1. Pha dung dịch thử nghiệm:
Pha dung dịch thử: mẫu FL-SA được hòa tan và điền đầy bằng methanol trong bình định mức 10 ml. Lọc qua màng lọc 0,22 àm.
Pha dung dịch đối chiếu: hũa tan astragalin (250 àg/ml) và isoquercitrin (100 àg/ml) bằng methanol. Lọc qua màng lọc 0,22 àm.
3.4.5.2. Điều kiện điện di:
Sau các thử nghiệm khảo sát, các điều kiện điện di được chọn như sau:
- Điện thế 25 kV - Nhiệt độ cột: 25 oC
- Kỹ thuật điện di CZE - Bước sóng phát hiện: 265 nm
- Cột mao quản silica nung chảy (64,5 cm; 56 cm; chiều dài hiệu quả cm; 50 μm).
- Dung dịch điện di: dinatri tetraborat 45 mM; điều chỉnh đến pH 9,0 bằng acid boric;
phối hợp với methanol để được dung dịch điện di có 10% methanol.
3.4.5.3. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống:
Bảng 3.36: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình định lượng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng CE (n = 6).
TM
(phút)
Tỷ số diện tích CorrAT/CorrAIS
Hệ số bất đối 0,8 ≤ As ≤ 1,5
Độ phân giải Rs ≥ 1,5
Astragalin 11,12
RSD% = 0,32
4,34857
RSD% = 0,16 1,13 12,8
Isoquercitrin 12,65 RSD% = 0,45
1,73237
RSD% = 0,13 1,06 12,8
Kết quả: RSD% của thời gian di chuyển và tỷ số diện tích pic chuẩn hóa của các pic trong mẫu đối chiếu < 2%, độ phân giải >1,5; hệ số bất đối trong khoảng 0,8 – 1,5.
Nhận xét: quy trình đạt tính phù hợp hệ thống.
3.4.5.4. Thẩm định quy trình:
- Tính đặc hiệu: các điện di đồ như Hình 3.16, quy trình đáp ứng các yêu cầu về tính đặc hiệu của quy trình định lượng.
Như vậy, quy trình đạt tính đặc hiệu.
Hình 3.16.A: Điện di đồ mẫu đối chiếu astargalin, isoquercitrin và chuẩn nội.
Hình 3.16.B: Điện di đồ mẫu thử định lượng astragalin, isoquercitrin và chuẩn nội.
Hình 3.16: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp CE.
- Tính tuyến tính: pha 6 dung dịch đối chiếu có nồng độ từ 10; 20; 50; 100; 250 và 500 (àg/ml), tiến hành điện di theo cỏc điều kiện đó chọn.
Phương trình hồi qui của Astragalin Y = 0,0137x; R2 = 0,9981 Isoquercitrin Y = 0,0163x; R2 = 0,9984
Nhận xét: có sự tương quan giữa nồng độ và tỷ số diện tích pic trong khoảng khảo sát, các giá trị của hệ số tương quan R2 > 0,998.
- Độ chính xác: kết quả được trình bày ở Bảng 3.37, hai pic astragalin và isoquercitrin
Bảng 3.37: Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định lượng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng CE (n = 6).
Tên flavonoid
Hàm lượng flavonoid trong lỏ TNHC (àg/g)
Độ lặp lại Độ chính xác trung gian Isoquercitrin à = 128,6 ± 2,3 (RSD 1,79%) à = 126,0 ± 3,1 (RSD 2,32%) Astragalin à = 267,3 ± 6,0 (RSD 2,16%) à = 261,9 ± 9,7 (RSD 3,56%) - Độ đúng: kết quả được trình bày ở Bảng 3.38, pic astragalin và isoquercitrin đều có tỷ lệ phục hồi trong giới hạn từ 90 – 107%.
Bảng 3.38: Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bằng phương pháp CE (n = 9).
Tên flavonoid Tỷ lệ phục hồi
10% 20% 30% TB%
Isoquercitrin 103,30 103,35 100,96 102,54% (RSD =1,23%) Astragalin 97,01 101,59 101,07 99,89% (RSD = 2,21%) Nhận xét: quy trình đạt yêu cầu về độ chính xác và độ đúng.
- Giới hạn phỏt hiện LOD (àg/ml) và giới hạn định lượng LOQ (àg/ml):
LOD (àg/ml) LOQ (àg/ml)
Isoquercitrin 0,23 0,70
Astragalin 0,13 0,39
Kết quả phân tích thống kê ANOVA các kết quả định lượng alcaloid và flavonoid bằng hai phương pháp HPLC và CE (n = 6; Flt = 4,96):
Alcaloid Flavonoid
Crinamidin: Ftn= 0,97 Astragalin: Ftn = 0,85 6-hydroxycrinamidin: Ftn= 2,18 Isoquercitrin: Ftn = 1,30 6-hydroxypowellin: Ftn = 0,67
6-hydroxybuphanidrin: Ftn = 0,002 Undulatin: Ftn = 1,41 6-hydroxyundulatin: Ftn = 0,04
Nhận xét: các giá trị Ftn < Flt. Như vậy, không có sự khác biệt kết quả định lượng alcaloid và flavonoid trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC hoặc CE.
3.4.6. Phương pháp dấu vân tay (DVT)
Mẫu thử: alcaloid AL-SA hoặc flavonoid FL-SA chiết theo Sơ đồ 3.5.
Mẫu đối chiếu: các chất đối chiếu như trong phần định lượng alcaloid và flavonoid bằng phương pháp HPLC.
3.4.6.1. Phương pháp DVT – SKLM
Bản sắc ký tráng sẵn silica gel F254; chiều dài 10 cm; chiều rộng giữa các vết khoảng 1cm; khai triển một lần ở nhiệt độ phòng.
Dung môi: Mẫu thử alcaloid: cloroform – methanol – dd amoniac (5 : 1 : 0,05) Mẫu thử flavonoid: cloroform – methanol – acid formic (3 : 1 : 1) Tiến hành: chấm riêng biệt trên bản mỏng khoảng 20 μl dung dịch thử và đối chiếu.
Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 10 cm. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại và hiện màu bằng TT Dragendorff (alcaloid) hoặc TT FeCl31% (flavonoid).
Hình 3.17: Sắc ký đồ DVT – SKLM alcaloid TNHC.
Dung môi: cloroform – methanol – amoniac (5 : 1 : 0,05).
Phát hiện: đèn UV bước sóng 254 hoặc 365 nm hoặc TT Dragendorff.
Rf1 ≈ 0,80 (undulatin) Rf4 ≈ 0,50 (crinamidin)
Rf2 ≈ 0,66 (6-hydroxyundulatin) Rf5 ≈ 0,42 (6-hydroxycrinamidin) Rf3 ≈ 0,60 (6-hydroxybuphanidrin) Rf6 ≈ 0,37 (6-hydroxypowellin) Đánh giá: sắc ký đầy DVT – SKLM alcaloid TNHC phải có ít nhất 6 vết có cùng màu sắc và tương đương Rf với vết CĐC tương ứng.
Hình 3.18: Sắc ký đồ DVT – SKLM flavonoid TNHC.
Dung môi: cloroform – methanol – acid formic (3 : 1 : 1)
Phát hiện: đèn UV bước sóng 254 hoặc 365 nm hoặc TT FeCl3 1%.
Rf1 ≈ 0,25 (isoquercitrin) Rf2 ≈ 0,30 (astragalin)
Đánh giá: sắc ký đồ DVT – SKLM flavonoid TNHC phải có ít nhất 2 vết có cùng màu sắc và tương đương Rf với vết CĐC tương ứng.
3.4.6.2. Phương pháp DVT – HPLC
Điều kiện: điều kiện sắc ký, các bước tiến hành xác định DVT alcaloid như Mục 3.4.2;
xác định DVT flavonoid TNHC như Mục 3.4.3.
Đánh giá: chọn các pic có tỷ lệ diện tích ≥ 5% tại λ = 214 nm (alcaloid); λ = 265 nm (flavonoid) để ghi nhận thời gian lưu tương đối, % diện tích và phổ UV.
- DVT – HPLC alcaloid TNHC: SKĐ mẫu thử có ít nhất 6 pic với đặc trưng như sau:
Pic Thời gian lưu (phút) % diện tích Phổ UV-Vis 1 9,0 ± 0,5 (6-hydroxycrinamidin) 21,9
Các pic alcaloid đều có phổ UV tương tự:
λmax = 214 nm vai ở 281 nm 2 10,5 ± 0,5 (6-hydroxypowelin) 17,8
3 13,5 ± 0,5 (crinamidin) 13,7
4 18,0 ± 0,5 (6-hydroxybuphanidrin) 20,8 5 20,5 ± 0,5 (6-hydroxyundulatin) 18,3
6 23,5 ± 0,5 (undulatin) 7,6
- DVT – HPLC flavonoid: SKĐ mẫu thử có ít nhất 2 pic với các đặc trưng như sau:
Pic Thời gian lưu (phút) % diện tích Phổ UV-Vis 1 11,5 ± 0,5 (isoquercitrin) 29,5 λ = 254 và 355 (nm) 2 18,5 ± 0,5 (astragalin) 70,5 λ = 265 và 346 (nm)
3.5. ĐỀ XUẤT MỘT SỐ CHỈ TIÊU CẦN THIẾT ĐỂ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU TNHC
Một số chỉ tiêu và phương pháp thử để đánh giá chất lượng dược liệu TNHC như sau:
Một số chỉ tiêu của TCKN lá TNHC
Lá phơi hoặc sấy khô của cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae).
Mô tả: lá khô có màu từ vàng nâu đến nâu sẫm, dai, mùi hăng đặc biệt, dài 50 – 90 cm, rộng khoảng 2 – 5 cm. Vị đắng.
Bột: mùi hăng, vị đắng. Mảnh biểu bì mang lỗ khí có tinh thể calci oxalat hình kim, tế bào hình đa giác thuôn dài. Mảnh mạch xoắn. Hạt tinh bột riêng lẻ, dạng hình bầu dục, tễ có hình sao. Cuộn sợi nhiều, sợi vách dày, khoang hẹp.
Độ ẩm: không quá 12% (DĐVN IV – Phụ lục 9.6).
Tro không tan trong acid hydrocloric: không quá 2% (DĐVN IV – Phụ lục 9.7).
Tro toàn phần: không quá 15% (DĐVN IV – Phụ lục 9.8).
Định tính: định tính hai nhóm hoạt chất alcaloid và flavonoid. Có thể thực hiện theo một trong hai phương pháp sau:
A. Phương pháp dấu vân tay sắc ký lớp mỏng: các bước tiến hành và phương pháp đánh giá được thực hiện theo Mục 3.4.6.1.
B. Phương pháp dấu vân tay sắc ký lỏng hiệu năng cao: các bước tiến hành và phương pháp đánh giá được thực hiện theo Mục 3.4.6.2.
Định lượng: định lượng hai nhóm hoạt chất chính là alcaloid và flavonoid.
Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Định lượng alcaloid:
Pha động: Dung môi A: methanol
Dung môi B: dung dịch acid phosphoric pH 3 và 0,2% TEA.
Dung dịch đối chiếu: hòa tan crinamidin và 6-hydroxycrinamidin trong pha động để cú dung dịch đối chiếu cú nồng độ lần lượt là 150 àg/ml và 100 àg/ml.