CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Quy trình chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid và phân đoạn flavonoid từ cây
Nguyên liệu thử nghiệm là loài Trinh nữ hoàng cung - Crinum latifolium L., họ Thủy tiên Amaryllidaceae, được xác định theo mô tả của các tài liệu [7], [11].
Các đặc điểm hình thái chính của nguyên liệu sử dụng trong luận án như sau:
Lá có màu xanh lục nhạt, mép cong. Cụm hoa tán đơn có 6 – 8 hoa mọc lên từ thân hành. Hoa to, đều, lưỡng tính, mẫu 3, màu hồng nhạt, mùi thơm. Bao hoa dính nhau bên dưới thành một ống hẹp hơi cong ở đỉnh khi hoa nở, bên trên chia thành 6 phiến;
mặt trong màu trắng, mặt ngoài màu trắng hồng, giữa phiến có một dải màu tím hồng.
Nhị 6, đều, rời, chỉ nhị dạng sợi, cong, màu trắng, bao phấn hình chữ C. Một vòi nhụy đính ở đỉnh bầu, dạng sợi, màu trắng, 1/5 về phía ngọn màu tím, đầu nhụy dạng điểm.
Hình 3.1: Hình lá và cụm hoa của cây TNHC (Crinum latifolium L.)
Hình 3.2: Hình hoa Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)
3.1.1. Quy trình chiết hoạt chất bằng phương pháp ngấm kiệt
Kết quả khảo sát chiết hoạt chất từ bột lá, thân hành và rễ TNHC bằng phương pháp chiết ngấm kiệt:
- Hiệu suất chiết: theo Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Hiệu suất chiết (%) hoạt chất bằng phương pháp ngấm kiệt.
Bộ phận Lá Thân hành Rễ
Cao cồn (H %)
CL-96 CL-70 CL-50 CH-96 CH-70 CH-50 CR-96 CR-70 CR-50 21,00 25,10 30,30 35,70 40,50 50,70 10,20 12,60 15,80 PĐ flavonoid
(H %)
FL-96 FL-70 FL-50 FH-96 FH-70 FH-50 FR-96 FR-70 FR-50 1,20 2,00 2,50 0,55 0,61 0,65 0,34 0,35 0,33 PĐ alcaloid
(H %)
AL-96 AL-70 AL-50 AH-96 AH-70 AH-50 AR-96 AR-70 AR-50 0,40 0,80 0,60 0,25 0,20 0,20 0,75 0,75 0,70
- Nhận xét:
Nồng độ cồn không ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất chiết, tuy nhiên:
- Với cả 3 loại nguyên liệu, khi chiết hoạt chất bằng cồn 50% tốn nhiều thời gian vì dịch chiết có nhiều tạp phân cực nên thời gian tách lớp giữa cloroform với dung dịch kiềm kéo dài. PĐ alcaloid, PĐ flavonoid rất nhiều tạp màu và tạp của chất nhày.
- Cao cồn 96% nhiều tạp clorophyl nên hiệu suất PĐ alcaloid và PĐ flavonoid kém hơn đối với mẫu bột lá.
- Cồn 96% hiệu quả cả về hiệu suất và độ tinh khiết của các cao chiết đối với mẫu bột rễ và bột thân hành.
Như vậy, để chiết đồng thời cả hai nhóm hoạt chất alcaloid và flavonoid trên nguyên liệu TNHC bằng phương pháp ngấm kiệt:
- Với mẫu bột lá, chọn dung môi cồn 70%.
- Với mẫu bột rễ và bột thân hành, chọn dung môi cồn 96%.
Tỷ lệ giữa dược liệu và dung môi là (1 : 10).
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết cao cồn, alcaloid và flavonoid từ lá TNHC.
Sơ đồ 3.2 Sơ đồ chiết alcaloid và flavonoid từ rễ TNHC.
3.1.2. Chiết hoạt chất từ lá TNHC bằng phương pháp SFE và ngấm kiệt 3.1.2.1. Kết quả khảo sát chiết alclaoid và flavonoid bằng phương pháp SFE Các yếu tố nhiệt độ 50 oC, áp suất 250 bar, thời gian chiết 120 phút được cố định để khảo sát dung môi chiết:
a. Chiết bằng 100% CO2: sản phẩm chiết là khối bột nhão màu vàng (50 g ≈ 1,25%).
Sau khi tinh chế, hỗn hợp này gồm 2 thành phần:
- Cắn màu trắng dạng bột được xác định là hợp chất phytosterol.
- Lớp dầu có acid palmitic (52,3%), acid oleic (9,9%), acid linoleic (14,5%), acid stearic (12,7%), acid linolenic (8,6%) và 9,11-octadecadienoic (2,1%) khi định danh bằng phương pháp GC-MS.
b. Chiết bằng CO2 và 15% cồn 96%: cồn 96% được tẩm vào dược liệu 6 giờ trước khi chiết với tỷ lệ 1 L/kg. Tổng lượng cồn sử dụng là 15% so khối lượng CO2. Sản phẩm có màu xanh đậm, dạng đặc sệt. Kiểm tra bằng SKLM, sản phẩm này dương tính với TT của alcaloid và flavonoid. Vì vậy, thử nghiệm được tiếp tục khảo sát yếu tố thời gian chiết và áp suất.
b1. Khảo sát thời gian chiết: kết quả Bảng 3.2 cho thấy sau 120 phút đã chiết hơn 94% so với tổng lượng hoạt chất chiết được sau 240 phút.
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian lên hiệu suất chiết.
Thời gian chiết (phút) 60 120 180 240
Hiệu suất L-SFE (%) 9,30 15,6 15,9 15,9
Hiệu suất PĐ AL-SFE (%) 0,085 0,109 0,113 0,116 Hiệu suất PĐ FL-SFE (%) 0,563 0,694 0,716 0,707 Thời gian chiết cho thử nghiệm tiếp theo được chọn 120 phút.
b2. Khảo sát áp suất chiết: áp suất được thay đổi từ 150, 200 và 250 bar.
Kết quả trình bày ở Bảng 3.3 cho thấy hiệu suất chiết alcaloid và flavonoid đều tăng, (alcaloid tăng gấp đôi) khi tăng áp suất từ 150 bar đến 200 bar. Tuy nhiên khi tăng áp suất lên 250 bar thì hiệu suất alcaloid giảm đáng kể, trongkhi yêu tố này không ảnh
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của áp suất lên hiệu suất chiết.
Áp suất (bar) 150 200 250
Hiệu suất cao L-SFE (%) 11,50 15,10 13,30 Hiệu suất PĐ AL-SFE (%) 0,165 0,346 0,151 Hiệu suất PĐ FL-SFE (%) 0,870 0,970 0,955
Nhận xét kết quả khảo sát chiết hoạt chất từ lá TNHC bằng phương pháp SFE:
- Nếu dùng 100% dung môi CO2 siêu tới hạn thì cao L-SFE âm tính với TT của alcaloid và flavonoid. Thành phần cao của L-SFE chủ yếu là acid béo và phytosterol.
- Nếu dùng thêm ethanol thì thành phần PĐ FL-SFE dương tính với TT FeCl3 1%.
Tuy nhiên cao FL-SFE không có các vết flavonoid khi so sánh với PĐ flavonoid chiết bằng phương pháp chiết ngấm kiệt và chiết dùng sóng siêu âm.
Như vậy, các điều kiện khảo sát chưa thật sự hiệu quả đối với nhóm flavonoid.
- Với alcaloid, SKLM cho thấy thành phần của alcaloid AL-SFE có đầy đủ các vết alcaloid tương ứng khi so sánh với PĐ alcaloid chiết siêu âm và ngấm kiệt, vì vậy có thể nhận định rằng các điều kiện khảo sát có hiệu quả với nhóm alcaloid.
- Các điều kiện chiết xuất mẫu lá bằng phương pháp SFE được xác định như sau:
Nhiệt độ: 50 oC Thời gian chiết: 2 giờ
Áp suất: 200 bar Dung môi hỗ trợ: 15% cồn 96%
Dược liệu được làm ẩm bằng cồn 96% khoảng 12 giờ trước khi chiết (1 L/kg).
- Kết quả ở Bảng 3.3 khi so sánh với kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy hàm lượng flavonoid và alcaloid vẫn còn trong dược liệu sau khi chiết bằng phương pháp SFE.
Như vậy, dược liệu cần phải được chiết tiếp bằng phương pháp ngấm kiệt để chiết thêm lượng hoạt chất còn lại.
3.1.2.2. Chiết alcaloid và flavonoid sau khi dược liệu được chiết bằng phương pháp SFE
Phần dược liệu sau khi chiết bằng phương pháp SFE được tiếp tục chiết bằng phương pháp ngấm kiệt bằng cồn 70% (Sơ đồ 3.3).
Sơ đồ chiết alcaloid và flavonoid từ lá TNHC kết hợp hai phương pháp chiết:
Sơ đồ 3.3 Sơ đồ chiết alcaloid và flavonoid từ bột lá kết hợp hai phương pháp chiết.
Từ 600 kg lá tươi, sau khi xử lý thu được 50 kg bột lá, chiết hoạt chất theo Sơ đồ 3.3, thu được các loại cao với hiệu suất như sau:
- Chiết SFE chỉ thu được alcaloid SFE (AL-SFE) 0,24%.
- Chiết ngấm kiệt: alcaloid (AL-NK) 0,60% và flavonoid (FL-NK) 1,20%.
Nhận xét kết quả chiết alcaloid và flavonoid từ lá và rễ TNHC:
- Các PĐ alcaloid AL-SFE, AL-NK và AR-96 màu vàng óng, thể chất đồng nhất, mùi thơm đặc trưng. AL-NK và AR-96 xuất hiện cắn màu trắng ngà ngay trong mẫu sau khi thu hồi dung môi, đây là thuận lợi cho bước phân lập các chất tinh khiết tiếp theo.
- Các PĐ flavonoid FL-NK và FR-96 màu xanh đen, đồng nhất, mùi thơm đặc trưng.