CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.3 Các phương pháp xác định các chất màu tự nhiên trích ly từ vỏ quả măng cụt và quả mặc nƣa
2.2.3.1 Phổ UV-Vis
Để xác định sơ bộ thành phần các nhóm chức có thể tồn tại trong dịch chiết, xác định số nối đôi liên hợp, bước sóng cực đại, độ hấp thu quang A, tính độ tận trích của dịch chiết lên vật liệu, thông thường xác định bằng cách kiểm tra quang phổ khả kiến- tử ngoại (UV-Vis).
Một số ít nhóm chức có thể xác định nhờ phổ UV-VIS, nhƣng đặc biệt hữu ích là xác định sự có mặt và giải thích bản chất của các hệ liên hợp có vòng thơm.
Các chất có màu là do trong phân tử của các chất chứa nhiều nhóm nối đôi hay nối ba nhƣ C=C, C=O, C=N, N=N, CC, NN, -NO2… Do vậy, chúng đƣợc gọi là nhóm mang màu. Nếu trong phân tử có nhiều nhóm mang màu liên hợp tạo thành mạch dài thì màu của chất sẽ càng đậm. Các chất màu đậm khi đo phổ tử ngoại khả kiến cho max nằm ở vùng có bước sóng dài. Dựa vào max, có thể biết được loại liên kết:
max < 150nm: chỉ có loại liên kết σ của hợp chất no
max > 150 nm: có liên kết đôi
max quanh vùng 200÷260 nm có thể có benzen và dẫn xuất của benzen
max >280 nm: hệ liên hợp
max càng lớn thì hệ liên hợp càng dài
Hầu hết các phân tử hữu cơ trong suốt trong một phần của phổ điện tử đƣợc gọi là vùng tử ngoại (Ultraviolet-UV) và vùng khả kiến (visible-VIS) với các bước sóng từ 190÷800 nm.
Phổ tử ngoại và khả kiến của hợp chất hữu cơ gắn liền với các mức năng lƣợng electron. Nói chung các bước chuyển xảy ra giữa một orbin liên kết hay cặp electron không chia sẽ và một orbin không liên kết hay phản liên kết. Khi đó bước sóng hấp thụ là số đo khoảng cách của các mức năng lƣợng giữa các orbin. Khoảng cách năng lƣợng lớn nhất đƣợc tìm thấy khi các electron ở liên kết bị kích thích, cho hấp thụ trong vùng 120÷200 nm.
Có hai định luật thực nghiệm được sử dụng tính cường độ hấp thụ. Định luật lambert phát biểu rằng phần tia tới bị hấp thụ phụ thuộc vào cường độ của nguồn. Định luật Beer phát biểu rằng sự hấp thụ tỷ lệ với phân tử hấp thụ. Từ các định luật này có phương trình của định luật Beer-Lambert nhƣ sau [17]:
A = log (2.5) Trong đó:
Io và I: cường độ của tia tới và tia phản xạ tương ứng L: chiều dày của dung dịch hấp thụ tính bằng cm C: nồng độ dung dịch tính bằng mol/l
Footer Page 63 of 148.
52
: độ hấp thụ phân tử gam và có thứ nguyên là 1000 cm2/mol, đây là tính chất của phân tử tham gia bước chuyển electron và không phải là hàm số của các thông số thay đổi khi chuẩn bị dung dịch.
A: độ hấp thụ hay mật độ quang
Kích thước của hệ hấp thụ và xác suất mà bước chuyển electron sẽ xảy ra, sẽ kiểm soát độ hấp thụ, nằm trong khoảng từ 0÷104. Các giá trị trên 104 được gọi là sự hấp thụ có cường độ cao, trong khi giá trị dưới 103. Các bước chuyển bị cấm có độ hấp thụ nằm trong khoảng từ 0÷1000. Định luật Beer - Lambert đƣợc tuân theo hoàn toàn chỉ khi các dạng đơn lẻ gây ra sự hấp thụ. Tuy nhiên, định luật không thể tuân theo khi một số các phân tử khác đang hấp thụ nằm ở trạng thái cân bằng, khi chất tan và dung môi kết hợp tạo một số dạng phức, khi cân bằng nhiệt tồn tại giữa trạng thái electron cơ bản và trạng thái kích thích ở mức thấp, hay khi các hợp chất huỳnh quang hoặc các hợp chất bị biến đổi nhờ bức xạ có mặt trong dung dịch.
Độ truyền qua T đƣợc định nghĩa: T=
Phần trăm truyền qua T%: T% = .100
Các mối quan hệ giữa mật độ quang A, độ truyền qua T nhƣ sau: A= - logT
Kết quả xác định UV-Vis đƣợc thực hiện trên thiết bị Evolution600 UV-Vis Spectrophotometer tại phòng thí nghiệm trường Đại học Công nghiệp Tp. Hồ Chí Minh.
2.2.3.2 Phương pháp quang phổ hồng ngoại IR hay FT-IR
Để định tính phổ hấp thụ của các hợp chất mang màu có trong dịch chiết và trên vải sau nhuộm bằng chất màu trích ly từ vỏ măng cụt và quả mặc nƣa, sử dụng phổ hồng ngoại IR (infrared spectrometer hay spectrophotometer).
Khi các phân tử hấp thụ năng lƣợng từ bên ngoài có thể dẫn đến quá trình quay, dao động xung quanh vị trí cân bằng của nó. Tùy theo năng lƣợng kích thích lớn hay nhỏ có thể xảy ra quá trình quay, dao động hay cả quay và dao động đồng thời. Để kích thích các quá trình trên có thể sử dụng tia sáng vùng hồng ngoại (phổ hồng ngoại) hoặc tia khuếch tán Raman (phổ Raman). Bức xạ hồng ngoại liên quan đến phần phổ điện từ nằm giữa vùng khả kiến và vùng vi sóng có bước sóng nằm trong vùng hồng ngoại gần: 14290÷4000 cm-1 và hồng ngoại xa 700÷200 cm-1. Vùng phổ có ý nghĩa quan trọng nhất là vùng giữa 4000 và 400 cm-1.
Thiết bị đo phổ IR đƣợc gọi là phổ kế IR, có hai dạng phổ kế IR đƣợc sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm hóa học hữu cơ là thiết bị phổ tán sắc và thiết bị biến đổi Fourier (Fourier transform- FT). Cả hai dạng thiết bị đều cung cấp phổ của các hợp chất trong vùng thông thường 400÷4000 cm-1. Mặc dù hai dạng đều cung cấp các phổ hầu như đồng nhất đối với hợp chất đã cho, song phổ FT-IR cung cấp phổ IR nhanh hơn nhiều so với thiết bị tán sắc [12,17].
Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại là một trong những kỹ thuật phân tích rất hiệu quả. Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp phổ hồng ngoại hơn hẳn những phương pháp phân tích cấu trúc khác như nhiễu xạ tia X, cộng hưởng từ…là phương pháp này cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi các phương pháp tính
Footer Page 64 of 148.
53
toán phức tạp. Kỹ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là các hợp chất hóa học có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại. Sau khi hấp thụ bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các hợp chất hóa học dao động với nhiều vận tốc dao động khác nhau và xuất hiện chùm phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng với các nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học. Do mỗi dạng liên kết có tần số dao động khác nhau và do hai dạng liên kết nhƣ nhau trong hai hợp chất khác nhau ở trong môi trường xung quanh khác nhau, nên hai phân tử với cấu trúc khác nhau sẽ có phổ IR khác nhau [17].
2.2.3.3 Phổ Raman
Phương pháp phổ Raman (Raman Spectroscopy) và phổ IR có mối quan hệ gần nhau, vì cả hai phương pháp đều bắt nguồn từ các bước chuyển của các mức năng lượng dao động và quay của phân tử khi hấp thụ bức xạ điện tử, song chúng rất khác nhau về cơ chế. Phổ IR là phổ hấp thụ, trong khi phổ Ramnan là phổ tán xạ. Phương pháp phổ IR và Raman bổ sung lẫn nhau. Chẳng hạn, các nghiên cứu về góc liên kết, độ dài liên kết và các xác nhận cấu trúc đòi hỏi số liệu Raman để bổ sung cho các nghiên cứu IR.
Cường độ của hấp thụ IR phụ thuộc vào sự thay đổi tính khả phân cực của liên kết khi kích thích. Do đó, liên kết đối xứng về mặt điện học không hấp thụ trong vùng IR (tức là bước chuyển bị cấm , nhưng nó lại hấp thụ tán xạ Raman (tức là bước chyển cho phép). Nói một cách khác, liên kết đối xứng về mặt điện học là liên kết hoạt động Raman và không hoạt động IR. Tuy nhiên, các liên kết không đối xứng về mặt điện học có thể hoạt động IR và không hoạt động Raman hoặc hoạt động cả IR và Raman.
Vì ánh sáng bị tán xạ với cường độ thấp hơn ánh sáng tới được phát hiện trong phổ Raman, sự phát triển của phương pháp phổ Raman chậm hơn phương pháp phổ IR cho tới khi áp dụng laser, có cường độ cao và độ đơn sắc tốt. Việc áp dụng laser để làm nguồn sáng trong máy phổ Raman là giai đoạn quan trọng trong sự phát triển của phương pháp phổ Raman.
Máy phổ Raman không bị hơi ẩm tấn công và sự có mặt của nước trong mẫu không gây trở ngại gì. Do đó, ngược lại với phương pháp phổ IR, việc nghiên cứu phổ Raman có thể tiến hành trong dung dịch nước [7,19].
Kết quả đo phổ Raman sử dụng trong luận án đƣợc thực hiện tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Tp. Hồ Chí Minh và thiết bị Tensor 37 tại phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia, trung tâm Vật liệu Polymer và composite, đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh.
2.2.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS
Phương pháp phổ khối lượng MS (Mass Spectrometry có ý nghĩa rất quan trọng đối với việc nghiên cứu xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Dựa trên các số khối thu đƣợc trên phổ có thể xây dựng cấu trúc phân tử hoặc chứng minh công thức cấu tạo dự kiến. Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các ion dương mảnh có số khối z = m/e (m là khối lượng còn e là điện tích ion . Sau đó phân tách các ion này theo số khối và thu đƣợc phổ khối lƣợng. Dựa vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu.
Footer Page 65 of 148.
54
Sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ (LC-MS hoặc HPLC/MS-Liquid chromatography–
mass spectrometry) là một kỹ thuật phân tích kết hợp khả năng phân tích lý học của sắc ký lỏng (HPLC) với khả năng phân tích khối lƣợng của phân tích khối phổ (MS). LC-MS là một kỹ thuật đầy tiềm năng, ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, có độ nhạy và tính chọn lọc cao, đƣợc sử dụng để xác định sự có mặt của nhiều hợp chất khác nhau trong một hỗn hợp phức tạp [60]. Phương pháp này được ứng dụng nhiều trong thực phẩm, dược phẩm, hóa chất nông nghiệp và ngành công nghiệp khác và sử dụng nhiều trong việc xác định các thành phần của các chất chiết xuất từ tự nhiên.
Phương pháp LC-MS được sử dụng trong luận án nhằm mục đích phân tích vết (ppb, ppm) của các hợp chất mang màu cần định danh có mặt trong dịch chiết từ vỏ quả măng cụt và quả mặc nƣa. Kết quả LC-MS của luận án đƣợc thực hiện trên thiết bị LCMS 6100 tại trung tâm Phân tích Công nghệ cao, Tp. Hồ Chí Minh.
2.2.3.5 Phương pháp nhiễu xạ Rơnghen (XRD)
Tia X là bức xạ điện từ năng lƣợng cao, chúng có năng lƣợng trong khoảng 200 eV ÷1 Mev hay bước súng trong khoảng từ 10-8 m đến 10-11 m. Tia X hay tia Rửntgen là một dạng của sóng điện từ, có bước sóng trong khoảng 0,01÷1 nm tương ứng với dãy tần số 30 PHz
÷30 EHz và năng lƣợng 120 eV÷120 keV. Tia X đƣợc phát ra khi các electron hoặc các hạt mang điện khác bị hãm bởi một vật chắn và xuất hiện trong quá trình tương tác giữa bức xạ γ với vật chất. Hiện tƣợng nhiễu xạ tia X là hiện tƣợng các chùm tia X nhiễu xạ trên các mặt tinh thể của chất rắn do tính tuần hoàn của cấu trúc tinh thể tạo nên các cực đại và cực tiểu nhiễu xạ. Kỹ thuật nhiễu xạ tia X đƣợc sử dụng để phân tích cấu trúc chất rắn, vật liệu... Xét về bản chất vật lý, nhiễu xạ tia X cũng gần giống với nhiễu xạ electron, sự khác nhau trong tính chất phổ nhiễu xạ là do sự khác nhau về tương tác giữa tia X với nguyên tử và sự tương tác giữa electron và nguyên tử. Nhiễu xạ là đặc tính chung của các sóng bị thay đổi khi tương tác với vật chất và là sự giao thoa tăng cường của nhiều hơn một sóng tán xạ. Quá trình hấp thụ và tái phát bức xạ electron còn gọi là tán xạ. Chiếu lên tinh thể một chùm tia Rơnghen, mỗi nút mạng trở thành tâm nhiễu xạ và mạng
tinh thể đóng vai trò nhƣ cách tử nhiễu xạ. Nếu tia X chiếu vào nguyên tử làm các electron dao động xung quanh vị trí cân bằng của chúng, khi electron bị hãm thì phát xạ tia X. Quá trình hấp thụ và tái phát bức xạ electron này đƣợc gọi là tán xạ, hay nói cách khác photon của tia X bị hấp thụ bởi nguyên tử và photon khác có cùng năng lƣợng đƣợc tạo ra [19,20,24].
Hình 2.7 Sự phản xạ trên bề mặt tinh thể Hiệu quá trình nhiễu xạ trên hai mặt P1 và P2 là:
δ = BC+CD => δ = 2CAsinθ hay: δ =2dsinθ Để có cực đại nhiễu xạ thì δ=nλ
Trong đó n: là số nguyên λ là bước sóng tia X
Footer Page 66 of 148.
55
Vậy có công thức Bragg: λ = => d=
Để xác định sự tác động của các phần tử mang màu lên cấu trúc tinh thể và cấu trúc vô định hình trên vải tơ tằm sau nhuộm bằng dịch chiết từ vỏ quả măng cụt và quả mặc nƣa tối ưu, sử dụng phương pháp chụp XRD. Kết quả XRD của luận án được thực hiện trên thiết bị Siemen D 5000 (Brucker_Đức) tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Tp. Hồ Chí Minh. Thông số thiết bị đo với ống tia X bằng Cu có bước sóng Kα = 1,540 Ao điện áp 30 KW, cường độ dòng ống phát ra 0,01 A, góc quét 2θ, tốc độ quét 0,02 o/s.
2.2.3.6 Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography hay High-pressure liquid chromatography) có khả năng phân tích tuyệt vời với tốc độ rất nhanh và độ lặp lại cao [60]. Tùy theo bản chất của các quá trình sắc ký của pha tĩnh (SP xảy ra trong cột tách mà người ta chia Phổ HPLC thành các loại: sắc ký phân bố (PC) của chất tan giữa hai pha không tan vào nhau, sắc ký hấp phụ pha thường (NP-HPLC), sắc ký hấp phụ ngược hay pha đảo (RP-HPLC), sắc ký trao đổi ion (IEx-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC), sắc ký rây (sàng lọc) phân tử (FG-HPLC). Mặt khác, khi xem xét về trạng thái pha tĩnh, người ta lại chia thành sắc ký lỏng-lỏng (LLC) với pha tĩnh và pha động đều là chất lỏng và sắc ký lỏng-rắn (LSC) khi pha tĩnh là chất rắn, pha động là chất lỏng. Nói chung, quá trình tách trong kỹ thuật HPLC là quá trình tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hóa học, vừa có tính chất lý học. Nó là những cân bằng động xảy ra và diễn biến liên tục trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động trong những điều kiện nhất định [25].
Để xác định, định lƣợng và tinh khiết từng thành phần hợp chất mang màu có trong hỗn hợp dịch chiết từ vỏ quả măng cụt và quả mặc nưa, thường sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, phương pháp này cho kết quả đáng tin cậy, được thực hiện trên thiết bị HPLC tại trung tâm Phân tích Công nghệ cao, Tp. Hồ Chí Minh.
2.2.3.7 Phương pháp hiển vi điện tử quét SEM
Kính hiển vi điện tử quét SEM (Scanning Electron Microscope), là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật đƣợc thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật. Mặc dù không thể có độ phân giải tốt nhƣ kính hiển vi điện tử truyền qua nhƣng kính hiển vi điện tử quét lại có điểm mạnh là phân tích mà không cần phá hủy mẫu vật và có thể hoạt động ở điều kiện chân không. Một điểm mạnh khác của SEM là các thao tác điều khiển đơn giản hơn rất nhiều so với TEM khiến cho nó rất dễ sử dụng, đồng thời giá thành của SEM thấp hơn rất nhiều so với TEM, vì thế SEM phổ biến hơn rất nhiều so với TEM. Phương pháp SEM đặc biệt hữu dụng bởi vì nó cho độ phóng đại có thể thay đổi 10÷100.000 lần với hình ảnh rõ nét, hiển thị ba chiều phù hợp cho việc phân tích hình dạng và cấu trúc bề mặt [23].
Để xác định sự định hình và cấu trúc hình thái của vải trước và sau nhuộm bằng dịch chiết từ vỏ quả măng cụt và quả mặc nưa, thường sử dụng phương pháp chụp SEM, phương pháp này đƣợc thực hiện trên thiết bị JFM5500 tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Footer Page 67 of 148.