1.5.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ đóng vai trò chủ yếu trong quá trình sinh trưởng của sợi nấm. Nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình hình thành AGIs của nấm mốc A.oryzae là ở nhiệt độ 30- 320C. Nhiệt độ quá thấp A.oryzae phát triển chậm, thời gian nuôi cấy kéo dài. Nhiệt độ quá cao dẫn đến hô hấp quá mạnh, không tốt cho quá trình tạo sinh khối và hình thành AGIs [78, 149, 83].
1.5.3.2. Độ ẩm môi trường
Trong những nhân tố tác động vào sự phát triển của nấm mốc, độ ẩm có vai trò rất lớn. Độ ẩm môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử khoảng 45- 55% [78]. Độ ẩm của môi trường cũng như độ ẩm tương đối của không khí là yếu tố quan trọng quyết định sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và sự sản sinh bào tử. Cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị giảm trong quá trình nuôi nấm mốc phát triển.
Thành phần nước chiếm từ 70 ÷ 90% khối lượng cơ thể vi sinh vật, tất cả quá trình phân hủy thức ăn và các phản ứng chuyển hóa các chất trong tế bào đều diễn ra với sự có mặt của nước. Độ ẩm cao ảnh hưởng đến độ thoáng khí, ngược lại độ ẩm thấp quá sẽ kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của sợi nấm cũng như khả năng tạo enzyme [6]. Độ ẩm của môi trường liên hệ đến sự kết dính, ảnh hưởng đến độ thoáng khí. Từ đó ảnh hưởng
đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi cũng như khả năng sinh hoạt chất. Trong quá trình lên men trên môi trường lỏng, độ ẩm không giữ vai trò quyết định đến hiệu quả tổng hợp enzyme. Ngược lại, ở điều kiện lên men bề mặt trên môi trường rắn, vi sinh vật phát triển và sản sinh ra sản phẩm tại gần bề mặt cơ chất rắn có hàm lượng ẩm thấp. Do đó, việc cung cấp một lượng nước thích hợp và kiểm tra độ hoạt động của nước của cơ chất lên men là cần thiết. Hàm lượng ẩm cao hơn hoặc thấp hơn đều ảnh hưởng bất lợi cho hoạt động của vi sinh vật. Hơn nữa, nước có ảnh hưởng sâu sắc đến các tính chất hóa lý của cơ chất và do đó ảnh hưởng đến hiệu suất của toàn bộ tiến trình nuôi cấy [132]. Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối ưu của môi trường là 50 ÷ 60% và sự duy trì độ ẩm của môi trường ổn định trong quá trình nuôi đóng vai trò quan trọng. Độ ẩm tăng quá 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn độ ẩm thấp hơn 50% làm kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như giảm hiệu quả hình thành enzyme [132]. Khi nuôi cấy trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối thì độ ẩm môi trường sau khi cấy giống không được vượt quá 60% để tránh sự nhiễm khuẩn, vi sinh vật lạ [7].
1.5.3.3. Ảnh hưởng độ thoáng khí
A.oryzae hoàn toàn hiếu khí và chỉ phát triển trong điều kiện có oxy. Nếu bề mặt môi trường không đảm bảo sự thoáng khí, độ dày khối môi trường lớn sẽ dẫn đến thiếu sự lưu thông oxy và carbon dioxit, nấm mốc phát triển cục bộ. Một lượng nhỏ khí carbon là cần thiết cho Aspergillus nảy mầm nhưng nếu nồng độ này quá cao lại kìm hãm sự phát triển của chúng. Khi nuôi cấy nấm mốc bằng phương pháp bề mặt môi trường rắn cần chú ý tới độ dày khối môi trường để đảm bảo độ thoáng khí cần thiết cho sự phát triển của nấm mốc. Để đáp ứng điều kiện nuôi này, môi trường nuôi phải xốp, rải thành lớp không quá dày và phòng nuôi phải thoáng. Tiến hành đảo trộn định kì để tăng lưu thông khí và trao đổi nhiệt trong quá trình nuôi cấy [8, 14].
1.5.3.4. Điều kiện pH ban đầu của môi trường
Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt môi trường rắn pH môi trường ảnh hưởng ít, do môi trường có dung lượng đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi mấy trong quá trình nuôi. Tuy nhiên pH ban đầu của môi trường cũng có ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển của nấm mốc và sự tạo enzyme. Như đối với A. awamori pH ban đầu là 6,3 thì nấm mốc tạo α- amylase cực lớn. Nếu pH ban đầu là 3 thì nấm sợi sẽ tạo ra nhiều oligo-1,6-glucosidase và α-1,4-amyloglucosidase. Phần nhiều A.oryzae phát triển trong phạm vi pH từ 4 – 8 nhưng một số nấm mốc có khả năng chịu được cơ chất
có pH acid hơn hoặc kiềm hơn. pH môi trường thuận lợi cho sự phát triển của A.oryzae thường là môi trường axit yếu pH 5,5 – 6,5 [149].
Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt môi trường rắn, do môi trường có dung dịch đệm cao và hàm ẩm thấp nên giá trị pH của dịch trích ra sau lên men thường ít thay đổi trong suốt thời gian nuôi cấy. Tuy nhiên, giá trị pH ban đầu của môi trường lên men có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của nấm mốc và sinh hoạt chất. Khi pH môi trường dịch về phía acid hoặc phía kiềm, sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme hoặc hoạt chất bị kìm hãm. Mặc dù vậy, tùy thuộc vào đặc điểm từng enzyme, từng hoạt chất, loại cơ chất và nguồn nấm mốc, giá trị pH tối ưu cho hoạt động của vi sinh vật lên men, tạo ra hoạt chất là khác nhau. Thêm vào đó, trong quá trình sinh tổng hợp enzyme, pH thường giảm nhẹ vào thời gian đầu do sự phân hủy các chất, điển hình như sự chuyển hóa các protein thành các acid amin mang tính acid, sau đó pH thường tăng dần do quá trình trao đổi chất tạo ra các chất mang tính kiềm như ammonium,… Tuy nhiên, quá trình này còn phụ thuộc vào từng vi sinh vật và sản phẩm tạo thành [6]. Như đối với quá trình sinh tổng hợp pectinase từ các Aspergillus, việc điều chỉnh pH ban đầu của môi trường giữ vai trò rất quan trọng. đã nghiên cứu khả năng phát triển và sinh enzyme từ A. foetidus và A. awamori trong các hệ thống lên men môi trường rắn trên các môi trường có giá trị pH khác nhau. Kết quả cho thấy rằng, pectinase thu được có hoạt tính cao khi môi trường nuôi cấy có bổ sung dung dịch HCl ở nồng độ cao. Các nghiên cứu chuyên biệt cho quá trình lên men sinh tổng hợp pectin methylesterase nhận thấy, tùy thuộc vào từng loại cơ chất lên men và việc điều chỉnh pH bằng dung dịch đệm khác nhau cũng có ảnh hưởng đến hiệu quả thu nhận enzyme [52, 89]. pH môi trường lên men phụ thuộc vào nguồn nấm mốc phân lập [146]. Điều này cho thấy, cần có sự khảo sát cẩn thận điều kiện môi trường, đặc biệt là pH khi thay đổi chủng nấm mốc sử dụng, điều kiện lên men.
1.5.3.5. Tỷ lệ giống
Tỷ lệ giống có vai trò chi phối tạp nhiễm. Nếu tỷ lệ tiếp giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp. Nếu tỷ lệ tiếp giống quá cao, dù thời gian nuôi cấy rút ngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do không đảm bảo đủ dinh dưỡng. Trong thực nghiệm thường sản xuất với tỷ lệ tiếp giống A.oryzae từ 104 – 107 CFU/g [149]. A.oryzae thường được bảo quản ở điều kiện môi trường giữ giống, để “đánh thức” giống, tiến hành nuôi tăng sinh ở các điều kiện tối ưu cho A.oryzae phát triển, A.oryzae phát triển đạt đếm mật độ tế bào phù hợp tiến hành tiếp giống lên men tạo sinh khối và hình thành AGIs [7, 14].
1.5.3.6. Thời gian lên men
Thời gian lên men là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển và hình thành AGIs bằng A.oryzae. Vi sinh vật cần thời gian phát triển. Tuy nhiên, thời gian lên men quá dài, môi trường cạn dần chất dinh dưỡng, vi sinh vật phát triển kém và do đó khả năng hình thành AGIs giảm. Khảo sát thực nghiệm là phương pháp phổ biến để xác định được thời gian lên men thích hợp giúp thu được AGIs hiệu quả. Việc tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm sinh hoạt chất, quá trình sinh hoạt chất nhiều thường kết thúc khi nấm bắt đầu sinh bào tử. AGIs được tạo ra từ A.oryzae thường lên men trong thời gian khoảng 36 – 72 giờ. Nếu thời gian quá ngắn hoặc quá dài nấm A.oryzae cho hiệu quả hình thành AGIs không cao [18, 7, 99].